产前母体感染促进后代的组织特异性免疫和炎症

Prenatal maternal infection promotes tissue-specific immunity and inflammation in offspring

Science [IF: 47.728]

DOI：https://doi.org/10.1126/science.abf3002

发表日期：2021-08-27

第一作者: Ai Ing Lim¹

通讯作者：Yasmine Belkaid(ybelkaid@niaid.nih.gov)^1,7

合作作者: Taryn McFadden, Verena M. Link, Seong-Ji Han, Rose-Marie Karlsson, Apollo Stacy, Taylor K. Farley, Djalma S. Lima-Junior, Oliver J. Harrison, Jigar V. Desai, Michail S. Lionakis, Han-Yu Shih, Heather A. Cameron

主要单位：

^1,7美国国立卫生研究院国家过敏和传染病研究所(Metaorganism Immunity Section, Laboratory of Immune System Biology and Laboratory of Host Immunity and Microbiome, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892, USA;NIAID Microbiome Program, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Bethesda, MD
20892, USA)

主题图

母体感染会促进后代肠道特异性免疫和炎症

母体感染期间，胎儿肠上皮细胞对IL-6的直接反应赋予成人肠上皮干细胞持久的表观遗传记忆。因此，后代上皮细胞对微生物群的反应性增强，控制口腔感染的能力增强。然而，这些反应是以增加肠道炎症的易感性为代价。

摘要

面对微生物的暴露，免疫系统已经进化。在不同发育阶段经历的母体感染如何塑造后代免疫系统仍知之甚少。 在此，我们表明在妊娠期间，母体限制性感染可对后代免疫产生永久的和组织特异性的影响。从机制上讲，感染反应中产生的母体IL-6可直接对胎儿肠上皮干细胞施加表观遗传学变化，从而对肠道免疫稳态产生长期影响。 因此，先前感染母鼠的后代对肠道感染产生增强的保护性免疫，并在结肠炎情况下炎症反应增加。因此，母体感染可与胎儿共同作用，以促进长期的组织特异性适应，这种现象可能是以易患炎症性疾病为代价的。

背景

免疫系统的一个基本特性是它能够发展对先前经历的记忆，从而增强对后续挑战的反应能力。尽管免疫记忆最初被描述为适应性免疫的一个决定性特征，但越来越多的证据支持另一个观点，即先天性系统的组成部分也可能受到炎性或感染性经历的深刻影响，这种现象被称为训练性免疫(trained immunity)。组织干细胞还可以形成对先前损伤的记忆，从而加快对后续挑战的反应。先天性印迹通常是短暂的，暴露后仅会持续几周到几个月。然而，父母的经历却可以在无脊椎动物中世代相传，这一现象也被猜测可能存在于脊椎动物中。尽管这一基本特性可能的机制仍然难以确定，但是我们已经知道过往的炎症性损伤对先天或干细胞的教育与表观遗传重编程相关，而且这是已经是一个活跃的研究领域。这种经过修正的对免疫的理解，应该包括整个生物体的经历，而不是只有专门的细胞。这提供了一个框架，以此来理解在生理环境中饲养的动物中观察到的增强的免疫适应性，这与在高度受控的实验室环境下饲养的动物形成对比。

宿主免疫印迹的概念在妊娠背景下特别有意义，它代表了免疫系统重要的发育窗口。妊娠与维持对胎儿耐受性的特定母体适应有关。与此同时，母亲可以通过子宫内和母乳喂养转移免疫调节因子(包括母体抗体和免疫细胞)来帮助后代抵御病原体。母体免疫激活也与后代全身性T细胞反应的改变有关。然而，从长远来看，母亲在怀孕期间经历的感染如何塑造后代组织免疫仍知之甚少。 事实上，我们目前的大部分理解来自于说明严重母体炎症或病原体感染(能够穿过胎盘屏障)的有害结果的研究。但是，妊娠期间遇到的应激源如何改变子代炎症性疾病的易感性仍不清楚。哺乳动物及其免疫系统是在微生物丰富的环境中进化而来的，因此频繁接触病原体和相关的保护性免疫是常态，并不是例外。宿主存活还需要优先考虑防御策略，以保护宿主免受组织损伤，在某些情况下，防御策略是限制感染严重性，而不影响病原体载量，这种现象被称为疾病耐受性(disease tolerance)。因此，到目前为止，大多数与微生物的接触都预计导致轻症或无症状。

在此，我们探讨了妊娠期母体感染可能对后代免疫系统产生长期影响的可能性。基于子宫内发生的基本发育过程，我们提出在特定发育窗口期经历的特定信号可能以离散和组织特异性的方式印记胎儿(On thebasis of the fundamental developmental processes that occur in utero, we proposed that specific signals experienced at specific developmental windows may im- print the fetus in a discrete and tissue-specific manner)。

结果

母体限制性感染诱导子代免疫的组织特异性改变

Maternally restricted infection induces tissue-specific alterations to offspring immunity

为了评估母体限制性感染对子代免疫的影响，我们使用了食源性病原体假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)的减毒株。这种特定菌株携带由III型分泌系统转位的效应蛋白(YopM)突变，导致轻度且短暂感染。在妊娠第10.5天，用突变株(yopM)对怀孕了特定时间的母鼠(Timed-pregnant dams)进行口服感染(图1A)。该特定时间点代表胎儿免疫系统的关键发育阶段，其特征为造血干细胞的出现和造血的开始。在yopM感染后，从感染后第5天至第8天，母鼠出现短暂的体重减轻，但未观察到其他症状。很短时间之后，怀孕了特定时间的母鼠在其粪便中脱落yopM，仅20%的怀孕母鼠经历了细菌播散至肝脏和脾脏。以与未怀孕小鼠相当的方式，怀孕母鼠在感染后第5天控制了在肠中的yopM，并在第9天清除了这些菌株。在试验的任何时间点，在胎肠、胎盘或胎肝中通过培养和PCR评估都未检测到细菌。此外，感染不影响产仔数。因此，yopM 感染代表了一种轻度、母体限制性感染的模型。

图1 母体限制性感染会导致后代免疫出现组织特异性改变

a 在妊娠第10.5天(E10.5)向怀孕特定时间的母鼠口服赋形剂(PBS)或Y. pseudotuberculosis yopM，并在5至8周龄时分析其后代mCtr或myopM；

b myopM子代的耳皮肤、肺、siLP和liLP中淋巴细胞亚群的细胞数量与mCtr子代的平均值相比的倍数变化；

c 左:由后代siLP TH亚群(以活CD45⁺CD90.2⁺TCRβ⁺CD4⁺Foxp3^-门控)表达的转录因子的代表性等高线图。右侧:T_H17 (RORγt+)细胞在总TH细胞中的频率，以及总siLP T_H17细胞数；

d 与相应年龄的mCtr子代平均值相比，myopM子代siLP中T_H17细胞数量的倍数变化；

e 接受赋形剂处理的母鼠或妊娠期间感染母鼠的后代(第1胎)或同一母鼠随后妊娠的后代(第2胎)中的siLP T_H17细胞总数；

f 将供体CBir1 Tg细胞(CD45.1)转移至同源mCtr或myopM后代(CD45.2)。在转移后第10至12天再次刺激后，分析受体后代siLP中的供体细胞的转录因子表达和细胞因子产生。等高线图采用活的CD45.1⁺CD90.2⁺TCRβ⁺CD4⁺Foxp3^-门控（Contour plots were gated on live CD45.1+CD90.2⁺TCRb⁺CD4⁺Foxp3^-）；

g myopM子代与mCtr子代回肠的全组织RNA-seq。上调基因用红色表示。(A至G)数据代表三个独立实验，每个实验中，每组有一或两只怀孕母鼠，每次怀孕使用3至5只后代。每个点代表一只老鼠。代表性流量图中的数字表示平均SD。 P < 0.05； P < 0.01， P < 0.001；** P < 0.0001；ns，不显著(双尾不成对学生t检验)。

接下来，我们比较了未感染的母鼠与之前感染的母鼠分娩的成年后代的淋巴细胞亚群。为此，我们对屏障组织(包括皮肤、肺以及5至8周龄后代的小肠(small lamina propria, siLP)和大肠固有层(large lamina propria, liLP))处的T细胞和先天性淋巴细胞(innate lymphoid cells, ILC)的数量、频率和表型进行了表征。与从未感染母鼠分娩的动物相比，妊娠期间母体感染与子代siLP中RORγt表达CD4⁺ T (T_H17)细胞的数量和频率显著和选择性增加相关(图1B和C)。T_H17细胞数量的增加仅限于肠室，在其他评估的屏障部位未检测到(图1B)。此外，在所有评估的区室中，未观察到其他淋巴细胞亚群数量的差异，包括T-bet表达CD4⁺ T (TH1)细胞、GATA3表达CD4⁺ T (TH2)细胞、Foxp3^-表达CD4⁺调节性T细胞[RORgt⁺调节性T细胞(Treg)和GATA3⁺ Treg]、CD8+ T细胞、γδ T细胞(γδT1和γδT17)和ILCs (ILC1、ILC2和ILC3)(图1B)。在断奶后(第3周)可检测到siLP内T_H17细胞蓄积增加，并在整个成年期(长达20周)持续存在(图1D)。在来自相同母鼠的后续窝中未观察到感染对后代肠道免疫系统的影响，这支持了母鼠增强后代免疫的能力不是由长期母体印记引起的观点(图1E)。因此，妊娠期间的短暂感染会对后代免疫造成长期、组织特异性的改变。

接下来，我们评估了这种现象是T细胞固有的还是由组织环境改变引起的。为此，我们评估了对照或先前感染母鼠所产后代对微生物组产生新反应的能力。将对确定的共栖衍生抗原具有特异性的转基因T细胞(CBir1 Tg细胞)转移到未感染或先前感染母鼠的后代中(图1F)。与前期研究一致，对照组小鼠的siLP中有少量CBir1 Tg细胞聚集，在此处基本保持未分化状态(图1F)。相比之下，由先前感染的母鼠分娩的后代的siLP中积累了较高数量的CBir1 Tg细胞，其中相当一部分细胞向T_H17细胞表型分化(图1F)。因此，母体感染可以通过增强对微生物组的反应性和促进T_H17细胞应答的方式影响后代肠道环境。为了支持这一观察，小肠的全组织RNA测序揭示了编码已知促进T_H17细胞(血清淀粉样蛋白A，serum amyloid A, Saa3)局部许可（local licensing）的因子的基因和T_H17细胞应答下游的基因(S100a8和S100a9)的上调(图1G)。

母体限制性感染会改变子宫内后代的肠道免疫

Maternally restricted infection alters offspring intestinal immunity in utero independently of the microbiota

感染会影响微生物组的组成、定位和功能。因此，我们接下来探索了T_H17细胞应答增强可能与获得感染改变的母体微生物组相关的可能性。通过Bray-Curtis主坐标分析(图2A和B)表明，受感染和未感染母鼠分娩的后代微生物组彼此紧密聚集。尽管在门水平上没有发生显著的转移(图2C)，但在先前感染的母鼠的后代中，属于拟杆菌目(Bacteroidales)和大肠杆菌目(Coriobacteriales)的少数分类群增加，而属于梭菌目(Clostridiales)和丹毒菌目(Erysipelotrichales)的少数分类群减少(图2D)。为了评估改变的微生物组对后代免疫的潜在贡献，通过对照和先前感染的母鼠分娩的新生儿被交叉喂养，直到断奶(图2E)。由先前感染的母鼠分娩并由对照母鼠喂养的后代携带的siLP
T_H17细胞的数量与由先前感染的母鼠分娩并培育的后代的数量相当(图2F至I)。相反，由对照母鼠分娩并由先前感染的母鼠培育的后代在siLP内没有增加数量的T_H17细胞(图2F至I)。这些数据支持以下假设：母体感染引起的肠道T_H17细胞应答升高是在子宫内获得的，而不是出生后或哺乳期母体微生物群改变所致。

图2 母体限制性感染会改变子宫内后代的肠道免疫，与微生物群无关

a 对怀孕特定时间母鼠口服赋形剂(PBS)或yopM，并在5至6周龄时通过16S rRNA基因测序分析其子代mCtr或myopM的粪便微生物群；

b 主坐标分析图，显示mCtr和myopM子代的粪便16S谱之间的Bray-Curtis距离。百分比表示每个主坐标对应的方差。显著性由PERMANOVA确定；

c mCtr和myopM粪便微生物群中门的相对丰度；

d 粪便微生物组物种的火山图。指出了在科水平显著改变的物种；

e 交叉培养实验。出生后24小时内，将赋形剂处理的母鼠所产下的后代转移至先前感染的母鼠(mCtr-fyopM)，反之亦然(myopM-fCtr)。交叉培养后代，直至断奶，并在5至8周龄时进行分析。在对照组中，子代由它们自己的母鼠饲养(mCtr-fCtr，myopM-fyopM)；

f 子代siLP中TH细胞亚群转录因子表达的代表性等高线图；

g siLP T_H17(rorγt+)细胞总数；

h 刺激后TH细胞产生细胞因子的代表性等高线图；

i 产生siLP IL-17A的TH细胞的总细胞数。

在(A)至(I)中，所有流式图均以活CD45⁺CD90.2⁺TCRβ⁺CD4⁺Foxp3^-门控(all flow plots were gated on live CD45⁺CD90.2⁺TCRb⁺CD4⁺Foxp3^-)。代表性流量图中的数字表示平均±SD。数据代表三个独立实验，每个实验中，每组一只怀孕母鼠，每次怀孕使用3至6只后代。每个点代表一只老鼠。
** P < 0.01；ns，不显著(单因素方差分析多重比较检验)。

妊娠期间升高母体IL-6水平足以增强后代肠道T_H17细胞应答和对微生物群的反应性

Increasing maternal IL-6 levels during pregnancy is sufficient to enhance intestinal T_H17 cell responses and reactivity to the microbiota in offspring

包括细胞因子在内的可溶性因子可穿过胎盘屏障。为了评估母体可溶性因子的潜在作用，我们在妊娠第13.5和15.5天将感染母鼠的血清转移至未感染母鼠(图3A)。我们证实没有细菌被转移，受体母鼠没有对yopM产生免疫应答。注射来自先前感染的母鼠的血清足以增加子代肠道中T_H17细胞的数量，其方式与母体yopM感染后观察到的方式相当(图3A)。我们评估了感染yopM的妊娠母鼠在感染后不同时间点的血清中细胞因子和趋化因子水平，结果现实四种细胞因子显著富集:白细胞介素-6 (IL-6)、干扰素-γ (IFN-γ)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和肿瘤坏死因子-α (TNF-α)(图3B)。向未孕母鼠单次注射IL-6，但不注射IFN-γ、G-CSF或TNF-α，足以以剂量依赖性方式增加子代siLP中的T_H17细胞数量(图3C)。注射后，母鼠的循环IL-6水平与先前在各种感染模型中报告的水平相当，并在注射后第3天恢复至基线。此外，IL-6在乳汁中没有增加。为支持潜在的经胎盘转移，在母体yopM感染和IL-6注射后，胎仔血清中IL-6水平升高。

图3 妊娠期间升高母体IL-6水平足以增强子代肠道T_H17和对微生物群的反应性

a 左:用yopM感染怀孕特定时间的母鼠，并在E13.5和E15.5将在感染后3天和5天采集的血清(d.p.i .)静脉转移至未孕母鼠。右:6周龄后代siLP中的T_H17细胞总数；

b 在E10.5，用yopM对定时妊娠母鼠进行口服感染。检测感染前或妊娠3、5或7d时采集的血清中的细胞因子和趋化因子水平；

c 怀孕特定时间的母鼠口服赋形剂或yopM或静脉注射指定剂量的IL-6，并在6周龄时分析其子代(mCtr、myopM或mIL-6)的siLP T_H17细胞总数；

分析了由经静脉注射10 μg IL-6 (mIL-6)的mCtr、myopM或dams所分娩的成年后代的(d至g) siLP子房室的总T_H17细胞数(d)、产生IL-17A的T_H17细胞的频率(e)、T_H17细胞产生IL-17A的综合平均荧光强度(iMFI)[iMFI =(IL-17A MFI)×(产生IL-17A的T_H17细胞的频率)] (f)以及血清淀粉样蛋白A水平(g)；

h、i 从6周龄时mCtr或mIL-6的siLP中分选CD4⁺ T细胞总量，并通过scRNA-seq进行分析；

h 显示CD4⁺T细胞表达谱的UMAP投影图。颜色表示根据全局基因表达的相似性聚集在一起的细胞；

i 指示T_H17细胞簇的典型或致病基因特征的表达水平和丰度的点图；

j 左侧:感染前2小时，用1 mg抗IL-6单克隆抗体或同型对照对感染yopM的母鼠进行预处理。右图:6周龄后代siLP中的T_H17细胞总数；

k Top:无菌定时妊娠母鼠在E13.5静脉注射赋形剂或10μg IL-6，其子代mCtr或mIL-6在无菌条件下维持或在无特定病原体的设施中按常规饲养3至6周龄。下图:6周龄后代siLP中的T_H17细胞总数。在(A)至(K)中，数据代表了三个独立实验[(A)至(G)和(J)至(K)]，每个实验涉及每组一只或两只妊娠母鼠，每次妊娠使用三至五只后代，或一个实验[(H)和(I)]，其中每组三只妊娠母鼠，每次妊娠使用一只后代。每个点代表一只老鼠。 P < 0.05； P < 0.01； P < 0.001；** P < 0.0001；ns，不显著（单因子ANOVA多重比较检验）。

IL-6以前与妊娠背景下的多种生物学结局相关，包括妊娠疾病。 此外，先前的一项研究表明，IL-6增强了母鼠中IL-17A的产生，IL-17A的产生可能导致子代中自闭症样障碍的发生。然而，在我们目前的研究中，妊娠期间IL-6水平的升高对妊娠没有不良影响，且与成年后代的社交偏好的可检测到的损害无关。实验环境中的一个显著差异是，我们的研究是在没有分段丝状细菌(SFB)的小鼠中进行的，这是一组以前与子代行为改变有关的细菌。

如在母体感染背景下所观察到的，IL-6注射显著增加了子代小肠所有切片中的T_H17细胞数量(图3D)。IL-6注射还与空肠和回肠中T_H17细胞产生的IL-17A水平显著增加相关(图3E和F)。支持IL-17A信号传导的增强组织许可(Supporting enhanced tissue licensing of IL-17A signaling)，母体感染和IL-6注射均增强了空肠和回肠中血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A)的产生(图3G)。IL-6注射液还诱导十二指肠CD8⁺T细胞数量小幅增加。基于液滴的3’单细胞RNA测序(scRNA-seq)分析显示，IL-6注射母鼠后代的siLP T_H17细胞表达较高水平的规范T_H17细胞标志物(Maf、Ahr、Ccr6、Il17a、Il17f和Il22)，但不表达与致病性T_H17细胞相关的基因，包括Tbx21、Gmzb、Ifng 和Csf2 (图3H和I)。因此，与母体感染增强T_H17细胞对微生物群的反应这一概念一致(图1F)，在这些条件下积累的T_H17细胞是非致病性的，可能参与屏障功能的控制。实际上，我们无法在IL-6治疗或感染母鼠的后代中检测到肠道细菌与宿主上皮之间距离的任何差异。为了解决IL-6不仅对母体yopM 感染对子代免疫的影响是充分的而且是必要的这一可能性，妊娠母鼠在yopM 感染前接受了中和IL-6抗体的治疗(图3J)。这种治疗不影响妊娠母鼠控制感染的能力。母体感染期间的IL-6中和作用显著降低了后代siLP中T_H17细胞的累积(图3J)。总之，我们的发现支持以下观点，即妊娠期短暂感染引起的母体IL-6水平升高会改变后代的肠道免疫。

尽管母体获得性微生物组的改变并不是导致后代免疫改变的原因(图2D和G)，但我们评估了妊娠期间和/或分娩后是否需要母体微生物群来重塑后代免疫应答。针对这一点，向无菌妊娠母鼠注射IL-6或赋形剂对照。如果后代维持在无菌条件下，则IL-6注射不会导致后代siLP中T_H17细胞累积增加(图3K)。然而，断奶后重新引入微生物群(常规化)与IL-6注射母鼠的后代中T_H17细胞数量增加相关，而与对照母鼠的后代中不相关(图3K)。因此，IL-6介导的组织印迹的产前建立和产后维持独立于母体微生物组，但允许后代对出生后暴露于微生物群产生增强的T_H17细胞应答。

妊娠期母体IL-6水平的升高会改变胎儿IEC的表观基因组

Increasing maternal IL-6 levels during pregnancy alters the epigenome of fetal IECs

对IL-6信号传导的反应由IL-6受体(IL6RA，也称为CD126)、糖蛋白130复合物和JAK-STAT3途径介导。IL-6还显示可穿过人和鼠的胎盘。为了研究IL-6对胎肠的影响，我们首先评估了IL6RA在胎肠上皮和造血细胞中的表达。我们发现IL6RA在所有胎肠上皮细胞(IEC)(EpCAM⁺)中以中等水平表达，在部分造血细胞(CD45⁺)中以高水平表达(图4A和B)。相反，IL6RA不被胎肺上皮细胞(EpCAM⁺)或胎皮肤角质形成细胞(CD49f⁺)表达(图4C)。与人类环境相关的是，对已发表数据集的再分析显示，IL6R在人类胎儿IEC中也以中间水平表达。为了确定对IL-6有反应的细胞区室，我们评估了yopM感染或IL-6注射后第1天和第3天的STAT3磷酸化。一小部分IEC在稳态下表达磷酸化的STAT3 (pSTAT3)，支持了上皮细胞发育过程中JAK-STAT3途径可能已经组成型参与的观点(图4D)。母体感染或IL-6注射后第3天，pSTAT3水平在胎儿IEC中进一步升高，但在造血细胞中未升高(图4D)。

图4 妊娠期母体IL-6水平的升高会改变胎儿iec的表观基因组

a 左侧:评估胎肠IL6RA (CD126)的表达。右侧:代表性直方图，显示在E15.5时通过胎儿IECs(IECs，CD45-EpCAM⁺)和造血细胞(CD45⁺)表达的IL6RA，荧光减去一个对照；

b E15.5时EpCAM和IL6RA染色的胎肠代表性显微照片。箭头指向由EpCAM⁺ IEC表示的IL6RA(用虚线表示)，比例尺，30μm；

c 代表性直方图，显示E15.5时由胎肺上皮细胞(CD45-EpCAM⁺)，胎皮肤角质形成细胞(CD45-CD49f⁺)和造血细胞(CD45⁺)表达的IL6RA；

d 左:赋形剂(mCtr)、yopM (myopM)或10 μg IL-6 (mIL-6)治疗后3天由胎仔造血细胞或母鼠iec表达的pSTAT3代表性直方图。右侧:造血细胞(CD45⁺)或iec(EpCAM⁺)中pSTAT3的iMFI；

e、f 使用赋形剂(mCtr)或静脉注射10μg IL-6(mIL-6)治疗3天后，来自母鼠的胎儿IEC的 ATAC-seq数据；

e 所有可及染色质区域的散点图。红点和蓝点分别对应于mIL-6胎仔和mCtr胎仔的IEC中差异可及区域的两倍以上；

f 左:与mCtr胎仔相比，mIL-6胎仔的差异可及启动子区(下一个转录起始位点3kb内的峰，倍数变化> 2)中富集的顶部基因本体(GO)术语。右图:UCSC基因组浏览器中感兴趣基因的快照。mIL-6子代中开放的启动子在灰色框中突出显示；

g 通过将Il6ra^fl/fl Vil1Cre雌性与Il6ra^fl/fl Vil1^Cre+雄性杂交，从IEC中删除Il6ra。向母鼠注射10μg IL-6，并在5至8周龄时分析子代的siLP T_H17细胞。在(A)至(G)中，数据代表了三个独立实验[(A)至(D)和(G)]，每个实验针对每组一至三只妊娠母鼠，或一个实验[(E)和(F)]，每个实验针对每组三只妊娠母鼠，每次妊娠使用四至七只后代。 P < 0.05；* P < 0.01；（G中的双尾不成对学生t检验和D中的单因素方差分析多比较检验）。

为了测试IECs可能是感染期间母体IL-6印记的直接靶组织的可能性，我们使对对照和IL-6注射母鼠的胎儿IECs的表观遗传学和转录组进行了表征。对于IEC身份具有重要意义的基因(包括Epcam、Vil1、Cdx1和Cdx2)在来自对照和IL-6注射母鼠的胎儿IEC中是同样可获得的。胎儿IEC中的开放染色质区富含转录因子结合基序，这些基序以前与肠发育(CDX1/2)、IEC分化(GATA和HNF4G)和上皮细胞身份建立(KLF)有关。然而，在全基因组水平上，妊娠期间注射IL-6后，胎儿IEC染色质可及性显著增加，来自IL-6注射母鼠的胎仔中有2118个区域可及性更高(超过两倍的变化)，而来自对照母鼠的胎仔的IEC中只有4个区域可及(图4E)。差异可及启动子区显示与肠生理功能相关的基因富集，包括肽转运、干细胞分裂、上皮发育和th细胞分化(如Jak2和Il10rb) 。相反，转录组学分析显示胎儿IEC有轻微改变。因此，在发育过程中暴露于IL-6会增加胎儿IEC的整体染色质可及性，对其转录景观的影响较小。

为了进一步评估IL-6信号对胎儿IEC调节肠道免疫能力的贡献，我们从IEC中特异性删除了IL-6受体基因Il6ra(图4G)。为此，我们采用了一种育种方案，允许IL-6信号在母鼠中保持完整(Il6ra^fl/fl Vil1Cre)，并允许后代的IEC为Il6ra充足(Il6ra^fl/fl Vil1Cre)或Il6ra缺乏(Il6ra^fl/fl Vil1^Cre+)。共焦成像证实，在Il6ra^fl/fl Vil1^Cre+小鼠的IEC中，IL6RA被选择性消融。怀孕期间注射IL-6后，与Il6ra^fl/fl Vil1Cre同窝仔对照相比，Il6ra^fl/fl Vil1^Cre+子代肠道中的肠道T_H17细胞显著减少(图4G)。因此，胎仔IEC中的IL-6信号传导对于赋予长期肠道免疫改变是充分和必要的。

出生前IL-6暴露改变肠上皮干细胞的染色质可及性和转录组

Prebirth IL-6 exposure alters chromatin accessibility and transcriptome of intestinal epithelial stem cells

既往谱系追踪研究显示，所有胎儿IEC均可向以Lgr5表达为特征的成人肠上皮干细胞(EpSC)池中分化。为了解决胎儿IEC改变可能对成年epsc产生长期后果的可能性，我们使用ATAC-seq(图5A)评估了对照或IL-6注射母鼠分娩的6周龄子代EpSCs(EpCAM⁺LG r5+)的染色质可及性。由IL-6注射母鼠分娩的成年子代的EpSCs中染色质可及性增加，其中1006个区域更开放(大于两倍的变化)，而对照子代的EpSCs中只有71个区域(图5B)。根据出生后和断奶期间上皮细胞发生的深刻变化可以预料到，开放染色质位点与在胎仔中观察到的位点在很大程度上不同，胎仔IEC和成年EpSCs之间只有17个共有峰(<胎仔的1%)。在IL-6注射母鼠后代的成体EpSCs中发现的差异可及启动子显示参与MAPK激活、细胞因子信号和防御反应的基因富集(例如，Alox5ap、Ptgs2、Mgst2和Ffar3) (图5C)。

图5 妊娠期间升高母体IL-6水平会改变后代肠上皮干细胞的染色质可及性和转录组

a 在E13.5向定时妊娠母鼠注射赋形剂或10μg IL-6。从其子代mCtr或mIL-6中分选肠EpSCs，用于6周龄时的ATAC-seq；

b 散点图，显示开放的染色质区域。红点和蓝点分别对应于mIL-6和mCtr子代的EpSCs中差异可及区域的两倍以上；

c 左:与mCtr EpSC相比，mIL-6 EpSC中差异可及启动子区域的GO术语分析(峰值在下一个转录起始位点的3 kb内，倍数变化> 2)。右图:UCSC基因组浏览器细胞因子信号传导相关基因快照。mIL-6子代中开放的启动子在灰色框中突出显示；

d 从mCtr或mIL-6子代中筛选出6周龄时scRNA-seq的IEC；

e IEC亚群的UMAP投影，基于每个亚群中与所有其他细胞相比的25个差异表达最多的基因进行分配；

f 每个IEC子集的频率；

g 富含mIL-6后代干细胞和肠细胞的前三个GO术语。对于以红色突出显示的选定GO术语，显示了mIL-6子代中上调的前五个基因。数据来自一项实验，每组有三只妊娠母鼠，每次妊娠使用一只后代。

在成人中，肠EpSCs不断自我更新并分化为具有离散功能的上皮细胞的不同亚群。因此，我们使用基于液滴的3’scRNA-seq来评估母体IL-6介导的EpSC改变对IEC组成和转录组的潜在后果(图5D)。我们将分析重点放在十二指肠和回肠，观察到母体IL-6注射后T_H17细胞增加最多(图3D)。无监督聚类将从对照(n = 34929个细胞)和IL-6注射(n = 34112个细胞)母鼠分娩的后代中分离的IEC分成21个聚类(图5E)。基于与不同细胞类型和分化状态相关的特征基因鉴定每个簇。在通过对照和IL-6注射母鼠分娩的后代之间未观察到细胞组成的显著差异(图5F)。相比之下，IL-6注射在不同分化阶段的特定IEC亚群(包括干细胞、转运扩增细胞和肠细胞亚群)中造成离散的转录组学改变。与对照母鼠相比，编码主要组织相容性复合体II (MHCII)机制的典型组分(包括Cd74、H2-Aa和H2-Ab1)的基因在由IL-6注射母鼠递送的子代的干细胞和肠细胞中均强烈富集，在十二指肠中观察到最强烈的差异(图5G)。最近有报告称，EpSCs表达MHCII和编码抗原呈递机制的基因是微生物群依赖性的，有助于上皮细胞分化。妊娠期间注射IL-6还与肠细胞中编码抗菌肽(如Reg3b和Reg3g)的基因表达增加有关 (图5G)。因此，妊娠期间IL-6的增加会对EpSC染色质可及性和下游上皮细胞功能产生长期影响。

母体感染或IL-6暴露促进子代肠道保护性免疫和炎症

Maternal infection or IL-6 exposure promotes offspring intestinal protective immunity and inflammation

上皮活化状态的改变和T细胞对先前感染或注射IL-6母鼠的后代肠道中微生物群的反应增强，表明这种现象可能与抗菌防御增强有关。为了解决这一假设，我们使用了鼠伤寒沙门氏菌(鼠伤寒沙门氏菌)口腔感染的急性模型(图6A)。在所用剂量和感染途径下，鼠伤寒沙门氏菌主要侵入IEC，然后传播至远端器官并导致宿主致死。尽管在感染后第1天和第2天没有观察到细菌脱落的差异，但到第4天，与对照母鼠的后代相比，注射IL-6的母鼠的后代在其粪便和Peyer斑中的细菌负荷显示出1-2对数减少(图6B和C)。妊娠期间IL-6的增强也减少了细菌向后代远端器官的播散，与对照组相比，肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏中的细菌负荷减少了2至3个对数(图6C)，感染后后代存活率显著提高(图6D)。与感染控制增强一致，与对照组相比，IL-6注射母鼠的后代中粘膜炎症标志物脂质运载蛋白-2也显著降低(图6E)。此外，在感染后2天，通过IL-6注射母鼠分娩的后代的IEC中，抗菌肽(如Reg3b和Pigr)显著增加。尽管IL-17A在控制鼠伤寒沙门氏菌中的直接作用尚不清楚，但感染该细菌与早期3型免疫应答相关。感染后第5天，与对照组母鼠相比，注射IL-6的母鼠后代的siLP中产生IL-17A-和IL-17A/IL-22的CD4⁺ T细胞(而不是ILC)的数量和频率显著增加(图6F)。在从iec中特异性删除Il6ra的小鼠中，通过在母鼠中注射IL-6提供的保护显著降低。此外，通过受yopM感染的母鼠分娩的后代也以与IL-6注射后观察到的方式相当的方式显示出对鼠伤寒沙门氏菌感染的增强控制。因此，母体感染和胎儿在妊娠期间经历的IL-6信号增强均可通过对上皮细胞的直接影响促进抗菌防御。在由IL-6注射母鼠递送的后代控制白色念珠菌皮肤感染的能力方面未观察到差异，这进一步支持了在此背景下后代的母体印迹限于肠室的概念。

图6 母体感染或IL-6暴露会促进后代肠道保护性免疫和炎症

a 在E13.5向怀孕特定时间母鼠注射赋形剂或10μg IL-6，并在5至8周龄时向其子代(mCtr或mIL-6)口服鼠伤寒沙门氏菌；

b、c 感染后第1至5天粪便中的鼠伤寒沙门氏菌载量(B)，以及感染后第5天组织中的鼠伤寒沙门氏菌载量(C)；

d 生存曲线；

e 感染后第1至5天的粪便脂质运载蛋白-2；

f 左:显示siLP TH细胞(CD45⁺CD90.2⁺TCRβ⁺CD4⁺Foxp3^-)产生细胞因子的代表性等高线图。右侧:IL-17A+和IL-17+IL-22+ siLP TH细胞总数；

g 定时妊娠的Rag1KO母鼠静脉注射PBS或10μG IL-6，其5至6周龄的后代(mCtr或mIL-6)腹腔注射来自野生型供体的分选的4×105幼稚T细胞(CD4⁺CD4 5 rbhicc 25)；

h、i 通过粪便脂质运载蛋白-2转运后6至8周评估肠道炎症liLP中的(H)和中性粒细胞总数(I)。

j 左:再刺激后liLP中供体CD4⁺ T细胞产生细胞因子的代表性等高线图。右图:liLP中IFN-γ、IL-17A和双生成因子的CD4⁺ T细胞总数。在(B)和(C)中，CFU检出限为每克器官102 CFU。代表性流量图中的数字表示平均SD。数据代表了两个或三个独立实验，每组一个或两个妊娠母鼠，每次妊娠使用三至六个后代。每个点代表一只老鼠。 P < 0.05；* P < 0.01；ns，不显著。[(G)中的双尾不成对学生t检验，以及(D)中的单因素方差分析多比较检验]

提高免疫力也可能以增加对炎性疾病的易感性为代价。为了检测母体感染和/或IL-6是否可能在上下文中促进后代的炎性反应，我们使用了两个定义明确的实验性结肠炎模型。使用未感染的T细胞转移模型，我们发现，与对照组后代相比，注射IL-6的母鼠的后代表现出增强的肠道炎症，这可通过liLP中粪便脂质运载蛋白增加和中性粒细胞数量增加得到证明(图6G至I)。此外，与对照子代相比，注射IL-6的母代的liLP中产生IFN-γ、IL-17A或两者(IFN-γ+ IL-17A+)的转移T细胞数量显著增加(图6J)。双重生成素的显著增加尤其令人感兴趣，因为细胞因子的这种特异性共表达是致病性T_H17细胞的特征之一。此外，与对照组相比，受yopM 感染或注射IL-6的母鼠的后代对葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎表现出增强的病理学反应，表现为体重减轻和结肠缩短增加。因此，母体感染导致的肠道免疫力增强也可能以增强炎性疾病的易感性为代价。

讨论

对微生物挑战的最佳反应对宿主存活至关重要。在此，我们表明妊娠是后代组织特异性免疫教育的关键阶段。我们证明，胎儿上皮细胞对母体感染期间产生的细胞因子的直接反应赋予了肠道干细胞持久的表观遗传记忆，我们认为这一现象有助于增强免疫力和诱发炎性疾病。最近的研究发现，在成人中，上皮干细胞可形成对炎性损伤的记忆，这一现象与对后续损伤的反应加快有关。我们目前的工作提出，即使是在产前发育期间遇到的短暂、轻度感染，也可能在出生前对肠上皮干细胞造成持久的改变，从而导致激活组织的阈值发生改变。

母体感染的影响是组织特异性的，主要由单一细胞因子IL-6介导。这一观察结果提出了一个有趣的可能性，即在胎儿发育期间，位于不同区室的干细胞可能受到高度特异性信号的教育，从而产生最佳的组织免疫。我们的发现也支持这样的观点，即母亲在怀孕期间经历的感染可能通过增强目标感染部位的反应，优化对后代中直接微生物威胁的反应。此外，之前曾有报告称IL-6在整个妊娠期间会升高，这一现象可能广泛有助于哺乳动物肠道免疫系统的教育。

尽管我们的数据表明母体微生物暴露可被胎儿所利用，以形成最佳的免疫适应性，但这一现象也可能有助于解释在人类群体中观察到的炎症性疾病显著增加的原因。事实上，母体环境的改变，加上调节性微生物伙伴(如蠕虫)的去除，可能有助于将母体诱导的免疫成熟的结果从保护性转变为炎症性。面对微生物或环境挑战，进一步探索母体-胎儿之间通讯可能为我们理解稳态和保护性的组织免疫以及宿主易患炎症性疾病提供更多见解。

收获

1 首先这篇文章揭示了一个非常有趣的现象。母体在怀孕特定时期轻微的感染会改变子代肠道干细胞的表观遗传记忆，进而对后代的免疫力和炎症反应产生持久的影响。我们不禁要问，在不同的时间、不同程度的感染，会不会对子代不同的器官、组织产生不同的影响呢？而这些影响又会是什么呢？

2 这篇文章从表型的改变入手，提出一个又一个的问题层层深入，并拿出扎实可靠的数据，最终将机制揭示。 这些问题包括但不限于：

1）在表型上，母体轻微的感染会给后代短期带来什么影响？
母体轻微的感染会导致后代免疫的组织特异性改变。
轻微的具体含义是什么？
研究人员使用一种病原体的减毒株来感染母亲，并确认是短期感染，几乎不影响其他器官，也不感染胎儿。
组织特异性的含义是什么？
在后代中，只有小肠固有层和大肠固有层中的Th17细胞增加。

2）这种免疫的响应，从母亲传递到后代的途径是什么？
这种免疫响应由IL-6通过胎盘传递。作者检测细胞因子和趋化因子的水平。血清中白细胞介素-6水平升高。然后他们做了大量的实验来验证IL-6的作用。例如，转移母体血清，单独注射白介素-6，使用IL-6抑制剂，条件敲除IL-6受体。

3）在后代免疫响应增强的肠道组织中基因组、表观组发生了什么变化？
研究者们做了多组学的分析，测了RNA-seq、scRNA-seq和ATAC-seq。RNA-seq数据显示，上调基因可促进TH17细胞的局部增加和T_H17细胞的下游应答。scRNA-seq数据显示，总CD4⁺ T细胞、T_H17细胞积累但不致病，可能参与屏障功能的控制。ATAC-seq数据显示，染色质可及性差异区域主要富集于肽转运、干细胞分裂、上皮发育和免疫细胞分化。这些结果可能有助于考虑如何检测这些免疫系统变化的影响和结果。

3 这篇文章干湿结合的方法是一种非常有效的研究策略。从表型变化着手，用多组学数据data-driven产生科学假设，然后用湿实验验证。这种策略会越来越多地用于探索生命现象背后复杂而又系统的机制。

编译：吴季秋（jwu@ucc.ie） 爱尔兰科克大学(UCC)

责编：马腾飞 南京农业大学

审核：刘永鑫 中科院遗传发育所

Reference

Ai Ing Lim, Taryn McFadden, Verena M. Link, Seong-Ji Han, Rose-Marie Karlsson, Apollo Stacy, Taylor K. Farley, Djalma S. Lima-Junior, Oliver J. Harrison, Jigar V. Desai, Michail S. Lionakis, Han-Yu Shih, Heather A. Cameron, Yasmine Belkaid. Prenatal maternal infection promotes tissue-specific immunity and inflammation in offspring. Science 373, eabf3002 (2021). https://doi.org/10.1126/science.abf3002