5-氨基水杨酸（5-ASA）治疗后UC患者真菌菌群的变化

Alteration of Fungal Microbiota After 5-ASA Treatment in UC Patients

Inflammatory bowel disease 【Impact Factor 4.261】

DOI：https://doi.org/10.1093/ibd/izz207

发表日期：2020-03

第一作者：Xu Jun(徐俊)^1,2,3

通讯作者：Liu Yulan(刘玉兰 主任医师, liuyulan@pkuph.edu.cn)^1,2

主要单位：

¹北京大学人民医院消化内科(Department of Gastroenterology, Peking University People’s Hospital, Beijing, China)

²北京大学人民医院免疫介导消化疾病研究中心(Clinical Center of ImmuneMediated Digestive Diseases, Peking University People’s Hospital, Beijing, China)

³北京大学人民医院中心实验室(Institute of Clinical Molecular Biology & Central Laboratory, Peking University People’s Hospital, Beijing, China)

写在前面

分享标题：IBD: 5-氨基水杨酸（5-ASA）治疗后UC患者真菌菌群的变化

关键字：溃疡性结肠炎（UC），5-ASA，黏膜微生物，真菌菌群紊乱

导读

目前已有多项关于药物影响肠道菌群组成的研究，然而，UC患者最常使用的临床治疗药物——5-ASA对于UC患者肠道菌群的影响未见报道。细菌、真菌、寄生虫和病毒都是肠道微生物的重要组成部分，但在IBD的发病机制研究中，真菌菌群的作用往往处于次要地位。本研究则是重点关注5-ASA对于UC患者肠道真菌菌群的作用。

背景

炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD），包含溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）和克罗恩病（Crohn’s disease，CD）。宿主免疫与肠道微生物的相互作用的紊乱在IBD的发病过程中起到关键作用。目前有众多研究都在探索IBD患者肠道菌群的特点；但值得注意的是，绝大多数入组的患者都有使用5-ASA、硫唑嘌呤等药物治疗；然而，药物对于菌群的肠道菌群的作用在大多数研究中都被忽视。

有研究报道柳氮磺吡啶（SASP）能重塑三硝基苯磺酸（TNBS）肠炎小鼠的肠道菌群。SASP的化学结构中含有磺酸基团具有抗微生物的作用，因此SASP理应具有影响肠道菌群结构的特点。然而，5-ASA是UC患者最常使用的临床治疗药物，但其对UC患者肠道菌群的影响尚未见报道。本研究重点关注5-ASA对于UC患者肠道真菌菌群的作用。

结果

受试者临床资料

表1 探索性研究中UC患者的人口学和临床数据特点

该部分研究属于横向研究，入组的患者根据是否使用药物治疗，被分为UC未治疗组（Treatment-Naive）和5-ASA治疗组（5-ASA-Treated）。两组患者的性别有显著性差异（将在验证性研究中予以讨论）。依据Mayo评分，患者肠黏膜病变的严重程度被分为正常和非活动，轻度，中度和重度，各类患者比例相似。依据Montreal分型 (E1, proctitis; E2, leftsided; or E3, extensive)将患者的病变部位分为E1、E2和E3型，各类型患者比例相似。

表2 验证性研究中UC患者在5-ASA治疗前后人口学和临床数据特点

在探索性研究中，有10名未治疗的UC患者（Treatment-Naive）接受了课题组随访并纳入验证性研究。在验证性研究中，我们对UC患者治疗前后的人口学和临床数据进行了采集和分析。5-ASA治疗后，Mayo评分显著下降。病变严重的患者比例未0%，多数患者严重程度变为中度或轻度。该数据证实了5-ASA在UC患者治疗中的有效性。

5-ASA治疗后UC患者真菌菌群的多样性变化

Alteration of fungal diversity in UC patients after 5-ASA treatment

（1） 探索性研究中未治疗的和5-ASA治疗的UC患者之间的真菌多样性差异

我们比较了20名未治疗患者和37名5-ASA治疗UC患者的真菌菌群alpha多样性，包括Shannon、Richness和Simpson指数（图1a、1b和1c）。未治疗的UC患者中，与非炎性黏膜（UN）相比，在炎性黏膜（UI）中真菌菌群具有较高的丰富性，但均匀性较低。beta多样性分析表明，UN和UI组中的样本分群明显（Adonis p=0.0002，图1d）。我们进一步分析了未治疗和5-ASA治疗UC患者炎性黏膜（UI和AI）中的真菌特点。与 UI 组相比，AI 组中的Shannon指数更高（p=0.010）。此外，真菌β多样性显示所有样品的炎性黏膜中具有治疗特异性聚类（Adonis p=0.008，图1d）。

（2） 验证性研究中UC患者进行5-ASA治疗后真菌多样性的改变

在验证性研究中，我们进一步分析了10名接受随访的UC患者的肠黏膜真菌多样性。与5-ASA治疗前非炎性黏膜（preN）相比，治疗前的炎症黏膜（preI）中真菌richness较高（p=0.022），但均匀性较低（尽管不显著）（图1e、1f和1g）。对β多样性的分析表明，preN和preI组样本有明显的分群（p=0.011，图1h）。这些数据表明，在治疗前，UC患者在非炎性和炎性黏膜中真菌组成有显著差异。与preI组相比，5-ASA治疗后postI组炎性黏膜的富集度降低，但postI组的均匀度增加（虽然不显著）（图1D和1E）。此外，在5-ASA治疗后，在postN和postI组的样本在PCoA中没有明显的样本聚类，这反映了5-ASA治疗后非炎性和炎性黏膜中真菌成分的相似性。

图1. 探索性研究与验证性研究中UC患者黏膜真菌菌群多样性

图1. 探索性研究与验证性研究中UC患者黏膜真菌菌群多样性。探索性研究中UC患者真菌α多样性（a，香农指数；b，丰富度指数；c，辛普森指数）。（d）探索性研究中，基于Unifrac距离的真菌β多样性主坐标分析（PCoA）。UN，未治疗UC患者的非炎症性黏膜；UI，未治疗UC患者的炎性黏膜；AN，5-ASA治疗的UC患者的非炎症性黏膜；AI，5-ASA治疗的UC患者的炎症黏膜。验证性研究中UC患者真菌α多样性（e，香农指数；f，丰富度指数；g，辛普森指数）。（h）验证性研究中，基于Unifrac距离的真菌β多样性PCoA。preN，5-ASA治疗前UC患者的非炎性黏膜；preI，5-ASA治疗前UC患者的炎性黏膜；post-N，5-ASA治疗后UC患者的非炎性黏膜；postI，5-ASA治疗后UC患者的炎性黏膜。p<0.05，p<0.01，p<0.001，*p<0.0001，无显著性（ns）。

5-ASA治疗后UC患者真菌菌群的组成变化

Alteration of fungal composition in UC patients after 5-ASA treatment

（1） 探索性研究中未治疗的和5-ASA治疗的UC患者真菌成分的差异

与已有研究报道一致，Ascomycota是被鉴定的OTUs中最主要的真菌门（图2a）。在5-ASA治疗之前，在门水平上，UI组中的 Ascomycota的丰度低于UN组。在属水平上，UI组中的Scytalidium、Sporidiobolus、Vanrija和Verticillium的丰度高于UN组（图2b）。为了研究5-ASA治疗对真菌微生物群的影响，我们分析了炎性黏膜中的真菌成分。我们比较了UI和AI组中的真菌微生物群，包括门和属水平。我们发现，在AI组中，门水平上，Ascomycota的丰度减少，而在属水平上Mortierella、Scytalidium和Verticillium的丰度比UI组增加（图2a/b）。

（2） 在验证研究中，5-ASA治疗后UC患者真菌成分的改变

在验证研究中，Ascomycota是主要的真菌门。我们发现与preN相比，preI组的Ascomycota的丰度明显下降（图2c）。在属水平，Wickerhamomyces是占主导地位的属（图2e）。与preN组相比，Aspergillus、Morchella、Mortierella、Paecilomyces、Scytalidium显著增加，但preI组中Wickerhamomyces显著降低（图2d，2f）。

我们还评估了5-ASA治疗对真菌微生物群的影响。与5-ASA治疗前炎性黏膜（preI）相比，Ascomycota的丰度显著增加，5-ASA治疗后的炎性黏膜（postI）中Zygomycota水平下降（图2c）。在属水平，相较preI，postI组Wickerhamomyces丰度明显增加；此外，5-ASA治疗后Scytalidium、Fusarium、Sporobolomyces、Paecilomyces、Morchella和Mortierella在postI组显著减少（图2d，2f）。

图2. 探索性研究与验证性研究中的真菌菌群组成

图2. 探索性研究与验证性研究中的真菌菌群组成。探索性研究中的门（a）和属（b）水平的真菌组成。UN，未治疗UC患者的非炎症性黏膜；UI，未治疗UC患者的炎性黏膜；AN，5-ASA治疗的UC患者的非炎症性黏膜；AI，5-ASA治疗的UC患者的炎症黏膜。验证性研究中门（c）和属（d）水平的真菌组成。（e）真菌系统发育树。我们挑选了100种真菌来建造系统树。可视化是在iTOL网站上进行的(https://itol.embl.de/)。内圈的颜色代表特定的真菌门。四个外圆代表四个不同的组，并且条高显示特定OTU的丰度。（f）真菌属在验证性研究中组间差异显著。preN，5-ASA治疗前UC患者的非炎性黏膜；preI，5-ASA治疗前UC患者的炎性黏膜；post-N，5-ASA治疗后UC患者的非炎性黏膜；postI，5-ASA治疗后UC患者的炎性黏膜。

验证性研究中的组特异性真菌菌群和差异真菌菌群

Group-specific microbiota and differential fungal genus in the validation study

首先，在验证研究中分析了组特异性真菌微生物群。在我们的验证研究中，共有1344个OTU，196个OTUs由所有组共有，但不同的组也有不同的真菌微生物群。281个OTUs只存在于非炎性黏膜中，617个OTUs只存在于炎性黏膜中。515 OTUs仅存在于5-ASA治疗前的肠道黏膜中，在5-ASA治疗后有291种新OTUs定植于肠道黏膜中。这些数据表明，在炎性黏膜中定植的真菌微生物群比非炎性黏膜多;此外，在5-ASA治疗后，在非炎性和炎性黏膜中殖民的真菌微生物群较少（图3a）。

我们进一步分析了四个组的组特异性真菌属，并确定了每组中的指示物种（图3b）。我们发现，以下真菌，如Udeniomyces, Sarocladium, Rhizopus, Paecilomyces, Myrothecium, Lentinula 和Laetisaria在治疗前的炎性黏膜中富含。治疗前，Paecilomyces往往是炎性黏膜的更好指示真菌属。值得注意的是，在5-ASA治疗后，很少真菌属在非炎性或炎性黏膜中被鉴定。

此外，为了研究治疗前炎性黏膜中的真菌表征，我们比较了preI组和preN组中的真菌属。我们发现Bipolaris在preI组中显著丰富。Humicola,Blumerla,Cryptococcus,Talaromyces,Aureobasidium, Eutypella和Schizophyllum 在preI组中明显减少（图3c）。

为了探讨5-ASA治疗对炎性黏膜真菌殖民化的影响，我们比较了5-ASA治疗之前和之后炎性黏膜中的真菌属。我们发现，Chaetothyriales,Chaetomium,Latorua,Aureobasidium和Cryptococcus都被富集，但Bipolaris在5-ASA治疗后在炎性的黏膜中缺失（图3d）。在5-ASA治疗（postI）后，这些在preI组的这些缺失的真菌属在炎性黏膜（postI）中富集。我们还将postI与postN组进行比较，以展示 5-ASA 治疗后炎性和非炎性黏膜之间的差异（图3e）。在postI组和postN组之间仅发现了少量差异真菌，这表明在5-ASA治疗后，在炎性和非炎性黏膜中，有相似的真菌定植特点。

图3. 验证性研究中的黏膜特异性真菌菌群

图3. 验证性研究中的黏膜特异性真菌菌群。（a）集合图(Upset plot)显示每组的OTU计数。（b）各组黏膜中的指示物种。以属水平真菌丰度为指标进行分析。点的形状代表OTU在群体中的富集或缺失，点大小代表OTU的丰度。两组（c，preI vs preN；d，postI vs preI；e，postI vs postN）之间OTU丰度的比较分析。采用edgeR软件包进行对比分析。两组之间的差异用曼哈顿图表示。点状显示，与后一组相比，前者的OTU富集、下降或不显著。点大小表示OTU的丰度。FC，变化倍数（fold change）。

验证性研究中UC患者肠道微生物的相互作用模式

Microbial interaction patterns of UC patients in the validation study

微生物相互作用（例如细菌-真菌相互作用）对于保持微生物稳态非常重要。为了探究验证性研究中的微生物相互作用网络，我们选择了丰度前50的细菌属和丰度前20的真菌属进行相关性分析。

在5-ASA治疗之前，尽管preN组中的微生物相互作用较弱，但仍存在细菌-真菌相互作用。在这些相互作用模式中，少数Firmicutes细菌（包括Enterococcus和Lactococcus）与Escherichia-Shigella之间存在负相互作用（图4）。Propionibacterium是一种用于合成丙酸的细菌，与Escherichia-Shigella、Roseburia、Bacteroides和Subdoligranulum均呈负相关。在真菌菌群中，Wickerhamomyces与Morchella、Penicillium、Fusarium、Anaerostipes呈负相关。值得注意的是，尽管在preI组中微生物相互作用更多，但细菌-真菌相互作用被打断，但细菌和真菌属之间建立的相关模式很少。

我们进一步分析了5-ASA处理后黏膜中的微生物相互作用模式。我们发现5-ASA处理后在非炎性黏膜（postN）中存在密切的细菌-真菌相互作用模式。在这种模式下，Wickerhamomyces与广泛地与Firmicutes 和Bacteroidetes产生了强烈的负性相互作用。此外，Enterococcus和Lactococcus与Ascomycota呈负相关。经过5-ASA处理后，在发炎的黏膜（postI）中重新建立了细菌-真菌相互作用模式。Propionibacterium也与Firmicutes和Proteobacteria广泛相关。此外，Enterococcus和Lactococcus与Klebsiella、Escherichia-Shigella、Parabacteroides、Bacteroides和Prevotella呈负性相互作用。这些数据表明5-ASA影响微生物相互作用模式，并且在5-ASA处理后一定程度上重建了炎性黏膜中被破坏的细菌-真菌相互作用。

图4. 验证性研究中的黏膜菌群的相互作用模式

图4. 验证性研究中UC患者的黏膜微生物相互作用模式。细菌（前50）和真菌（前20）的丰度采用Spearman检验进行交互作用分析。只有显著的相关性（p值<0.05）显示为边缘。边缘颜色表示正（绿）或负（红）相关，这取决于Spearman的相关系数。这些节点代表微生物属，它们的颜色代表微生物门。preN，5-ASA治疗前UC患者的非炎症性黏膜；preI，5-ASA治疗前UC患者的炎症黏膜；post-N，5-ASA治疗后UC患者的非炎症性黏膜；postI，5-ASA治疗后UC患者的炎症黏膜。

结论

我们观察到，在未治疗的UC患者中，炎性黏膜中病原性真菌定植增加，细菌-真菌相关性被破坏。5-ASA处理后真菌的多样性和组成发生了变化，其特征是炎性黏膜中真菌病原体的定植减少，被破坏细菌-真菌的相关性模式得以恢复。

通讯作者简介

刘玉兰，北京大学第二临床医学院（北京大学人民医院）消化内科主任医师，博士生导师。现任北京大学人民医院副院长、消化科主任。1985年毕业于哈尔滨医科大学，1993年于上海第二医科大学获博士学位，1995年在北京大学肝病研究所完成博士后的工作。1999-2000年在澳大利亚国家肝移植中心工作。30余年来一直从事消化系疾病的临床工作与基础研究。发表专业论文百余篇，主编专业论著多部，如《新编临床医学问答丛书消化系统疾病》、《整合肝肠病学-肝肠对话》等。擅长各种消化系统疑难疾病的。专业特长为复杂肝病和炎症性肠病的诊疗、脂肪肝的诊治、消化道早癌及食管狭窄的内镜下诊断及治疗。

学术任职：
中华老年医学会消化病学分会 主任委员；
中华医学会消化学分会肝胆疾病协作组 组长；
中华医学会消化病学分会 常委兼秘书长；
北京医学会消化专业委员会及消化内镜专业委员会 副主任委员；
世界卫生组织 ICD 11 专家组成员；
多项国家及省部级课题及科研成果 评审专家；
中华医学杂志等多本专业杂志 副主编、编委

Reference

Xu Jun, Chen Ning, Song Yang, Wu Zhe, Wu Na, Zhang Yifan, Ren Xinhua & Liu Yulan. (2019). Alteration of Fungal Microbiota After 5-ASA Treatment in UC Patients. Inflammatory Bowel Diseases 26, 380-390, doi: https://doi.org/10.1093/ibd/izz207