深海古菌在消耗甲烷的微生物群中固定和共享氮

Deep-Sea Archaea Fix and Share Nitrogen in Methane-Consuming Microbial Consortia

Science

Impact Factor 41.037

DOI：https://doi.org/10.1126/science.1178223

发表日期：2009-10-16

第一作者：Anne E. Dekas¹

通讯作者：Anne E. Dekas(dekas@gps.caltech.edu)¹ and Victoria J. Orphan(vorphan@gps.caltech.edu )¹

合作作者：Rachel S. Poretsky

主要单位：

¹美国加利福尼亚理工学院地质与行星科学系(Division of Geological and Planetary Sciences, California Institute of Technology, Pasadena, CA 91125, USA)

写在前面

分享标题：Science：深海古菌在消耗甲烷的微生物群中固定和共享氮

关键字：深海沉积物，甲烷氧化菌，生物固氮，氮预算，共生体，ANME-2/DSS

点评：大自然，神秘莫测，需要我们不断探索，因为我们不具备上帝视角，很多领域的研究成果可能只是冰山一角(区域内局部正确)，或者我们只是盲人摸象地认为其所以然，本研究中提到的海洋氮素预算失衡问题突出说明了在非传统和潜在的意想不到的栖息地中存在固定氮新来源的可能性，预示着我们对该领域有限地研究，还有许多未知，尽管有新的发现即，ANME-2/DSS共生联合体是海洋中氮的一种潜在来源，可能有助于平衡全球氮预算，但其对全球固定N输入的假设缺失部分的贡献程度是未知的，且它们的输入可能不是等式中唯一的缺失项，依然表明我们的海洋固氮菌的存货清单是不完整的，我们只是刚刚开始了解底栖海洋N₂固定的程度和重要性，且还发现一些违背常理地认知即，在充满铵盐的缺氧海洋沉积物中居然会发生N₂固定，由此看来我们对此研究依然任重而道远。

平衡氮预算

Balancing the Nitrogen Budget

为元素制定全球预算是一项艰巨的挑战，例如对可能未知的源或汇进行核算。未解决的海洋氮预算失衡表明，深海中可能还有其他生物固氮来源。Dekas等人利用高分辨率成像技术观察到深海沉积物中的厌氧甲烷氧化古菌直接同化同位素标记的N₂，并随后将氮转移到它们的硫酸盐还原细菌共生体中。古生菌的这种缓慢而耗费能量的转化依赖于甲烷，需要与相关的细菌伙伴进行物理接触。这种共生联合体是海洋中氮的一种潜在来源，可能有助于平衡全球氮预算。

摘要

固氮(固氮菌)微生物调节着各种生态系统的生产力。然而，在许多海洋环境中，固氮菌的特征是未知的。利用¹⁵N掺入的单细胞分辨率纳米二次离子质谱图像，我们发现深海厌氧甲烷氧化古菌固定N₂，在结构上与CN-相似，并与硫酸盐还原菌共生体共享产物。这些古菌群/细菌群已经被认为是底栖生态系统中主要的甲烷汇，我们现在也将它们确定为生物可利用氮的来源。古菌在固定N₂的同时保持其甲烷氧化速率，但降低其生长速度，这可能是为了补偿固氮带来的能量负担。这一发现扩展了已证实的能够促进N₂固定的呼吸能量下限，并揭示了全球碳，氮和硫循环之间的联系。

正文

固氮细菌(固氮菌)和古细菌将分子氮(N₂)转化为氨(NH₃)以进行同化。生物固氮作用抵消了微生物过程如反硝化和厌氧氨氧化对生物可利用氮的消耗，并为大多数不能直接吸收N₂的生物圈提供了氮源。许多光合作用的蓝细菌在海洋表层水域中固氮，并已成为海洋固氮研究的重点。最近，海洋反硝化和N₂固定的计算速率之间的差异表明，可能存在其他研究较少或目前未知的固氮微生物，并固定了大量的N₂。事实上，最近发现的在系统发育和生理上多样化的固氮菌，包括来自热液喷口的嗜热产甲烷菌，表明N₂固定可以发生在极端环境和深海生产力提高的局部生境中。

在这里，我们表明，介导了深海沉积物中硫酸盐依赖的甲烷(CH₄) (AOM) 厌氧氧化古细菌(属于ANME-2组)和细菌[脱硫球菌/脱硫球菌(DSS)]的共生聚集体具有固氮的能力。近年来，由于ANME-2 / DSS群落在海洋碳循环中的潜在关键作用及其神秘的专性共生性，人们已经对其进行了研究。这些联合体在CH₄浓度高的地区(例如冷渗漏区)最为丰富，但遍布整个大陆边缘沉积物中。它们目前是海洋CH₄释放到大气中的主要过滤器，消耗了海洋沉积物中多达80%的自然释放的CH₄；然而，ANME-2和DSS细胞偶联的具体机制仍不清楚。最近对ANME-2/DSS联合群落的宏基因组测序发现了N₂固定所需的固氮酶基因的存在(nif genes)。这个结果，连同初步的N同位素数据，表明群落内的微生物能够固定N素。我们使用了纳米级二次离子质谱(nanoSIMS)联用的亚微米级离子成像技术，并结合了荧光原位杂交技术(FISH)，明确地鉴定ANME-2物种为固氮菌，同时详细描述和量化了这些代谢上相互依赖的群落中个体成员内的氮同化模式。

我们收集了美国加州鳗河流域一个活跃的CH₄渗漏点的沉积物样品，并与CH₄和几个¹⁵N标记的N源中之一进行厌氧培养。在与CH₄孵育6个月后测得的所有AOM联盟中，都发生了固氮，这是通过共聚集的ANME-2和DSS细胞中的¹⁵N从¹⁵N₂的同化来证明的(图.1，A与B，和图. 2A)。联合体中的¹⁵N的富集高达10.5¹⁵N原子％，是未标记的ANME-2/DSS联合体中观察到的最高值的26倍(范围为0.35到0.4¹⁵N原子％)。无论是CH₄氧化(缺少CH₄的孵育)还是硫酸盐还原(用抑制剂钼酸钠(Na2MoO4)处理的孵育)的抑制都阻止了¹⁵N的结合(图2)，这意味着N₂固定需要CH₄氧化的ANME-2和硫酸盐还原的DSS伙伴之间的一种功能共生关系。来自¹⁵N₂培养中的其他微生物细胞未富集¹⁵N(最大0.38 ¹⁵N原子％，n=10个细胞)，这表明在整个培养期间¹⁵N₂的掺入对ANME-2/DSS联合体具有特异性，而不是由于一组无关的生物固定后减少¹⁵N的非特异性循环。还从¹⁵N标记的氰化物(C¹⁵N–)中掺入¹⁵N，C¹⁵N–是一种结构类似于N₂的有毒分子，已知会被一些(但不是全部)固氮菌解毒并吸收(图.1D与2A)。由固氮酶产生的广泛的底物识别被认为是蛋白质最初进化时的残留能力，当时它可能主要催化了N₂固定以外的反应[例如氰化物解毒]。

图 1 在与CH₄和不同的¹⁵N标记的N源孵育的沉积物中，有代表性的甲烷氧化菌ANME-2/DSS联合体中，¹⁵N掺入的多少及分布

Magnitude and distribution of 15N incorporation in representative methanotrophic ANME-2/DSS consortia from sediments incubated with CH4 and different 15N-labeled N sources, as indicated

如图所示，在与CH₄和不同的¹⁵N标记的N源孵育的沉积物中，有代表性的甲烷氧化菌ANME-2/DSS联合体中，¹⁵N掺入的多少及分布。 (A到E) 使用针对ANME-2(Eel932)的红色探针和针对Desulfobacteraceae(DSS658)的绿色探针进行FISH。(I到V)由FISH在(A)到(E)中成像的同一微生物群落的¹²C¹⁵N/¹²C¹⁴N比的离子显微照片，表明¹⁵N掺入的位置。不同的离子显微照片的尺度范围不同，最小值始终设置为自然丰度¹⁵N/¹⁴N。

图 2 氮源对细胞生长和呼吸速率的影响

Effect of N source on rates of cellular growth and respiration.

氮源对细胞生长和呼吸速率的影响。(A)将¹⁵N掺入到来自于每种指定的N来源和/或抑制剂一起孵育的大量沉积物中的ANME-2/DSS联合体中。每个数据点代表单个集合体中最多¹⁵N富集的离子图像(深度平面)的平均¹⁵N(原子％)的值。符号的大小和形状表示聚集体的孵育时间：小实心黑圈，1个月;小灰圈，3个月;大的灰色圆圈，4个月;大黑圈，6个月。水平虚线表示自然丰度¹⁵N/¹⁴N。NM，未测量。(插图)通过用4 '，6 ' -二氨基-2-苯基吲哚染色确定的N₂(虚线)和NH₄⁺(实线)温育中聚集体丰度(aggs)随时间的变化。误差条代表离均值1个标准差。(B)在不同的¹⁵N沉淀物孵育中硫化物的产生。每个数据点(正方形符号)代表在采样时单个培养瓶的值，并遵循(A)中相同的符号大小和颜色趋势。2-溴代乙磺酸(BES)对其无抑制作用。

基于群落联合体中¹⁵N的分布，N₂固定似乎主要由ANME-2介导。在带壳形态的聚集体中，¹⁵N标签集中在聚集体的中心，ANME-2生物质在此集中(图.1A和3)。此外，ANME-2/DSS聚集体显示¹⁵N富集与轻质δ¹³C生物质共定位，是甲烷氧化菌ANME-2物种的信号诊断(n=6个聚集体)。这与在用¹⁵N标记的铵盐(¹⁵NH₄⁺)和硝酸盐(¹⁵NO₃^-)修饰的培养物中观察到的大多数聚集体中¹⁵N掺入的可变模式不同，并且表明ANME-2古细菌中¹⁵N₂富集的增加归因于固氮活性，而不仅仅是物种之间蛋白质合成速率的变化(图.1)。

图 3 有代表性的带壳ANME-2/DSS聚集体中的一系列FISH和¹²C¹⁵N/¹²C¹⁴N离子图像显示了来自于¹⁵N₂的¹⁵N的结合随深度的分布

Serial FISH and ¹²C¹⁵N/¹²C¹⁴N ion images in a representative shelled ANME-2/DSS aggregate showing the distribution of ¹⁵N incorporation from ¹⁵N₂ with depth

有代表性的带壳ANME-2/DSS聚集体中的一系列FISH和¹²C¹⁵N/¹²C¹⁴N离子图像显示了来自于¹⁵N₂的¹⁵N的结合随深度的分布(左面板)。在FISH系列中，红色表示古细菌细胞，绿色表示细菌。右侧显示了聚集体内部(以古菌为主)与外部(以细菌为主)¹⁵N掺入量的比较。每个灰色数据点代表一个手绘ROI的¹⁵N/¹⁴N，近似于细胞的大小(1μm)。箱形图和须形图表示在聚合体中特定深度处的内部(ANME-2，红色)或外部(DSS，绿色)绘制的所有ROI的75%、中位数和25%的值。右边的插图显示了从单个深度为细胞聚集体的内部和外部部分指定的ROI的示例。所有离子显微图的值都从0.0036缩放到0.11。

通过单个聚集体收集的一系列FISH和SIMS图像揭示了AOM联合体中来自于¹⁵N₂的¹⁵N同化的三维分布(图.3)。聚集体外部的细胞组(DSS为主)与内部的细胞组(ANME为主)之间的¹⁵N原子％的差异随着对聚集体核心的渗透增加而变大，与内部日益纯净的ANME种群相对应(图.3)。虽然群体外部的富集量平均比内部少31%，但相对于自然丰度，群体外围的所有DSS细胞都富集了¹⁵N{平均15N原子％= 3.47外部[n = 313个感兴趣区域(ROIs)]和5.01％内部(n = 297个ROIs)，图3}，表明从ANME细胞内部到DSS占主导地位的外部有一条还原N的通道。相对于ANME细胞，DSS细胞中¹⁵N富集的减少与其他共生体¹⁵N标记研究中观察到的趋势一致，其中固氮与非固氮伙伴之间共享减少的N。共生体之间还原性N物种的转移很常见，通常是为了交换能量丰富的代谢产物或进行结构保护。两个伴侣之间新陈代谢和生长的内在变化也可能导致¹⁵N富集的抵消，并且此时不能排除两个同养伴侣以不同速率同时固定的可能性。

对从¹⁵N₂沉积物培养中恢复的nif序列的分析与之前报道的关于CH₄渗漏的特定的nifH进化枝一致。回收的各种nifH基因主要集中在从地理上较远的深海CH₄渗漏和鳗鱼河流域ANME-2/DSS联合体的全细胞富集报告的一个不同的序列分支中。该nifH进化枝的存在凸显了地理上遥远的CH₄渗漏处假定的固氮菌之间的强烈相似性。然而，它与已知的固氮菌的分歧曾尝试将该进化枝分配给推测的细菌或古细菌。因此，我们从培养物中收集并分析了部分nif操纵子，发现它们包含产甲烷古菌和一些非变形杆菌的厌氧固氮菌中典型的c型操纵子的基因序列(nifH、nifI1、nifI2、nifD和nifK)。此外，这些操纵子内的nifD系统类型属于一个得到良好支持的分支，其中包含从其他CH₄渗漏沉积物样本、产甲烷古菌和非变形杆菌固氮谱系中检索到的序列，这些序列很少在CH₄渗漏处发现，但已被假设为与古菌一起进行了横向基因转移(例如Clostridia和Roseiflexusspp.)(图.4)。在渗漏微生物的情况下，这些数据与这些操纵子的古细菌来源最为一致。部分操纵子的nifH片段聚集在假定为渗漏特异性的nifH分支内，表明该分支为古细菌，并支持我们将ANME-2古细菌指定为联合体中主要的固氮微生物。

图 2 全局比对后翻译的nifD序列的无根邻接树

Unrooted neighbor-joining tree of translated nifD sequences after global alignment

全局比对后翻译的nifD序列的无根邻接树。节点上指示了从85到100％(实心圆)和从70到85％(空心圆)的引导值。刻度条表示每个氨基酸位置的变化。在这项研究中获得的序列以粗体显示。替代性固氮酶是那些使用V-Fe和Fe-Fe辅助因子的酶(分别为vnfD和anfD)。罗马数字表示在(30)中最初定义的固氮酶簇。用数字表示的序列的名称可以在表S2中找到。

从能量的角度来看，ANME-2/DSS联合体中的固氮令人感兴趣；它的成本是所有合成代谢过程中最高的，每还原一个N₂分子需要多达16个三磷酸腺苷分子(相当于~800 kJ)。此外，与硫酸盐还原反应相结合的AOM被认为是已知的最低的能量生产代谢之一。在CH₄渗出时，耦合的CH₄氧化和硫酸盐还原反应会产生总共约40kJ/mol的CH₄，这必须由两个同养伙伴共享。尽管存在其他受能量限制的固氮微生物(例如产甲烷菌)，但据我们所知，没有每摩尔底物产生的能量少于ANME-2物种的。一种可能性是，在深海等不寻常的环境中，N₂固定装置的结构或机械差异可能会改变能量负荷。回收的nif基因与先前描述的基因的低的序列相似性表明其与所描述的固氮系统存在一定的偏差 (图.4)。

生长缓慢是活跃的固氮菌(包括产甲烷古菌)在N₂固定的能量负荷下的一种常见反应。因此，使用¹⁵N掺入作为生长的代名词，在本研究中，主动固定N的ANME-2/DSS联合体的生长速度平均比在铵中平行生长的聚集体慢20倍左右(图.2)。尽管ANME-2/DSS的生长速度受可用氮源的影响很大，但在N₂或NH₄上生长期间，联合体中AOM的生长速度相似(图.2B)。因此，不管在这些生物体中固定N2所需的确切能量量是多少，联合体似乎都通过在保持相似的呼吸速率的同时减缓生长来补偿N₂固定的能量负担。

ANME-2细胞对nif基因的维持及其在实验室中固定N的能力表明，它们在海洋环境中也是如此。尚未直接检测到深海CH₄渗漏中的固氮生物，但基于这些渗漏沉积物和动物群低的δ¹⁵N值，表明这些位置存在N₂固定。为什么在经常充满铵盐的缺氧海洋沉积物中会发生N₂固定，值得进一步考虑。一种解释是CH₄的渗流环境不同于典型的缺氧沉积物，因为C的主要来源(CH₄)并不伴有N，从而使其消费者受到N的限制，类似于光合细菌和好氧甲烷氧化菌。确实，来自Eel River Basin 的CH₄渗漏的孔隙水中铵的测量值变化很大，在6厘米的沉积物深度剖面上范围从101到16μM；这些浓度不会完全抑制培养的固氮菌产甲烷菌(如Methanococcusmaripaludis)中N₂的固定。即使在富含铵的沉积物中，也可能会出现N限制的局部区域(例如，在紧密堆积的微生物群落中)。此外，目前海洋固定氮预算的差异突出说明了在非传统和潜在的意想不到的栖息地中存在固定氮新来源的可能性。ANME-2/DSS联合体对全球固定N输入的假设缺失部分的贡献程度是未知的，但是它们的输入可能不是等式中唯一的缺失项。ANME-2中的N₂固定，结合从此处和以前的海洋沉积物中发现的nifH基因的多样性，表明我们的海洋固氮菌的存货清单是不完整的，我们只是刚刚开始了解底栖海洋N₂固定的程度和重要性。

Reference

Anne E. Dekas,Rachel S. Poretsky,Victoria J. Orphan. Deep-Sea Archaea Fix and Share Nitrogen in Methane-Consuming Microbial Consortia.Science, Vol. 326, Issue 5951, pp. 422-426 https://doi.org/10.1126/science.1178223

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