大家好，今天跟大家分享一篇牛犇老师（现任东北林大教授）2017年在PNAS上发表的关于玉米微生物组的文章。Simplified and representative bacterial community of maize roots

首先，我们看一下研究背景，植物相关微生物对宿主的生长和健康非常重要。通过大量的前期研究，我们知道宿主基因型和非生物因子影响植物微生物群落的组成。复杂的群落组成使研究微生物组与植物的互作十分困难。如何人工重建了一个极简，具有代表性的合成细菌群落显得极为重要。

许多研究已经建立起了简化微生物群落与宿主作用的模型。第一篇是本领域的第一大牛，诺奖候选人Jeffery Gordon组于2011年Science上在无菌小鼠体内成功地建立了人类肠道的简化细菌群落，并用于了解这些群落是如何受饮食影响的文章。第二篇是Julia Vorholt组在2014年在Plos genetics上发表将简化的细菌群落模型接种植物拟南芥的叶片，以表征几种植物基因是如何形成叶际菌群的文章。第三篇是植物微生物组领域大牛Jeffery Dangl组于2015年在Science上发表的文章，利用38株细菌组成的合成菌群，研究了免疫系统发生改变的突变体对根系菌体的塑造能力。那么是否能够构建一个简化的玉米根系微生物群落模型？

定殖于植物的微生物是由多个物种组成的复杂群落，复杂的群落组成使研究微生物组与植物的互作十分困难。

如何构建一个极简的玉米微生物组？

从以前分析植物相关微生物群落物种组成的研究中已有充分的证据表明，植物宿主具有很强的选择性，根相关群落与根际和非根际土壤中发现的群落明显不同，作者在实验室中重复在自然土壤中生长的根中形成的微生物群落的特征。从根、根际和块状土壤收集样本，并对16S rRNA的V4区域进行测序，得到高质量reads聚类为3,211个OTUs。图中可以看出宿主导致根与根际得群落组成与背景土壤有显著差异，在玉米微生物组中存在13个相对丰度高的门和17个低丰度的门，变形杆菌(84.4%)，厚壁菌门(4.3%)，拟杆菌门(3.5%)，放线菌(3.1%)。Proteobacteria,Firmicutes,Bacteroidetes和Actinobacteria四个菌门占据主要地位，在图中也发现Proteobacteria变形菌门在玉米根中显著富集，,Bacteroidetes拟杆菌门在根际富集。这表明玉米幼苗通过选择有限的属建立了根栖菌群落。这一发现表明，有可能通过根的选择，从优势属的池中组装一个具有代表性的，且比较简单的细菌合成群落。

宿主富集实验设计：作者使用表面消毒的种子，使其发芽然后将幼苗在土壤中种植一个星期左右，然后将根系在PBS中捣碎。
实验策略一：
用根组织悬浮液接种表面消毒的种子，然后将其放置在无菌1/2 MS培养基中生长。用超声方法将细菌从根系部分洗脱下来，然后在0.1× TSA培养基上进行培养。作者测序列了61个菌株Marker基因，这些基因属于16个不同的物种。其中变形杆菌门有14种，另外两种为产菌门C. indologenes和产菌门C. pusillum，分别属于拟杆菌门和放线菌门。分离到的14种变形杆菌分别来自嗜铬杆菌属Ochrobactrum和钩端螺旋体属Herbaspirillum; 我们从每一个物种中选择了一个，其中4株为肠杆菌属。我们选择了其中的两个分离株(阴沟肠杆菌E. cloacae和阿斯伯里肠杆菌Enterobacter asburiae)，因为在前人报道中这两种菌是甜玉米的根系内生菌 。然后作者将12株菌按每个菌10的8次方浓度等量混合，然后接种到10株幼苗上。
实验策略二：
作者直接将根系悬液涂布到0.1×TSA培养基上以获得单克隆菌株，从这些菌落中，作者共选取了33株菌。33株菌株均属于变形杆菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门。这些分离株，连同来自策略I的两个分离株Dyella sp.和C. pusilum以及前人研究透彻的 3株菌，Bacillus amyloliquefaciens解淀粉芽孢杆菌, Paenibacillus polymyxa多粘类芽孢杆菌和 Azospirillum brasilense巴西固氮螺菌，一共38株菌用于最后人工菌群构建实验，作者将38株菌按每个菌10的8次方浓度等量混合，然后接种到6株幼苗上。
图B经过5天生长后，作者用扩增子测序的方法来研究菌群的变化。Enterobacter占据主导地位，Raoultella ornithinolytica 解鸟氨酸菌和 Dyella sp戴氏菌属。几乎不可检测到，作者发现尽管策略二的菌株多很多，但是最后微生物群落的结构却很类似。作者确定了7种菌的人工菌群组合，然后用这7种菌等量接种幼苗，经过15天生长后，作者发现这7种菌都还稳定存在。 且在不同植株之间的差别很小。
第二张图是基于属水平筛选菌的实验，测试了替换属内不同成员的群落稳定性，E.asburiae的7种菌的组合和Ochrobactrum  otrici替换O. pituitosum 添加Paenibacillus polymyxa和 Azospirillum brasilense的9种菌组合结果相似。
当然这七个菌群绝不是唯一的组合可能。实际上，作者也测试了这7个属中的很多其它的种，作者把这7个菌加上其它种的菌一起测试，但也得到了和前面很类似的结果。这7个菌在玉米根系本来就属于高丰度菌。作者也通过OTUs分析了原本的菌群组成，并找到了这7株菌的代表性序列。
B-C图验证了7种菌的确存在于根的测序结果中。随后对7个菌进行了全基因组测序，说明这个简化群落可以作为一个研究根系定殖和细菌间相互作用的有效系统。

考虑到我们的模型群落的简单性和所有成员的可培养性，作者想出一种基于培养的、简单的、快速的、经济的方法来评估群落中每个成员的丰富度。
高通量测序在鉴定物种及丰度上很有用，但它也有很多局限性：1. 周期长；2. 它们并不特别适合于准确地确定群落中每个物种的绝对丰度；3.宿主DNA的干扰以及PCR扩增的错误。
为了弥补相对丰度的局限性，作者使用了表型微阵列技术(PM)。作者用7株菌的每种都评价了288种与化学敏感性和渗透反应的相关的培养条件。最后确定了七种可以和每株菌对应的，只允许一种菌生长的条件。对于每种菌，在选择性条件下的恢复率都接近于1. 菌悬液的组成以及玉米根部群落通过群落形成单位（CFU）和16S rRNA基因测序估值。两种方法得到了相似的相对丰度，通过两种方法得到的菌悬液的组成与期望值相似，由CFU确定的组成于期望值明显正相关 ，通过两种方式得到的在玉米根部的群落组成也相似。通过16s rRNA基因测序与通过CFU计数得到的群落结构也明显正相关。说明CFU方法可以用来确定组成
操作方法：100微升菌悬液包括每种菌和 BiOLOG染料放在每种板中，每个板都有培养基和染料的负对照。放30度48h，如果表型在孔中成正相关，会形成紫色，如果负相关，紫色会变浅。OD 590 减 OD 750用来定量颜色，选择出可以筛选每种菌的化学物质组成。10 μL  (108 cells per milliliter in PBS)包括每种菌的菌悬液涂在 0.1 × TSA 平板上，配制含有不同化学物质的培养基，然后对每种培养基上的CFU人工计数，计算回收率，在玉米的体内实验上，两种检测方法的结果也很相似，两种结果呈正相关。
通过CFU计数和扩增子测序比较相对丰度，证明CFU计数是可行性

从7个物种的简化群落中剔除一个，加上不剔除组一共8组接种无菌苗，统计CFU数观察种群动态变化。(BC差异度）进化树是根据Bray-Curtis距离指数进行聚类。通过香浓指数表征α多样性。首先不剔除的混合群落重复出上一页ppt中的结果3，再次验证这个重组的稳定性。时间轴上看，剔除实验的每组自身不同时间的整体动态大致相似，这些群落保持较高的均匀度，剔除E.cloacae的实验组导致群落α多样性在时间轴上显著变化。群落被C.pusillum主导，15天时其他物种接近消失或已经消失。在剔除P.putida的-Ppu组中，C.pusillum的相对丰度也增加，但没有-Ecl组那么显著，香浓指数也有体现。

一个关键的控制是确定玉米幼苗是否真的需要动态群落结构，为了验证这种可能性，作者在相同的系统中进行了对照实验，但没有玉米幼苗。在MS琼脂中接种7种混合菌;然后我们对细菌群落组成进行了15 d的动态跟踪，发现玉米根和MS琼脂上的群落确实存在显著差异，A-C说明在没有玉米的系统中7种菌相互作用和之前实验中显著不同，此外，当我们去除阴沟肠杆菌，并在没有幼苗的MS琼脂中跟踪其动态时，C. pusillum并没有接管全部菌群，D-F说明去除E.cloacae的实验组中，Agar实验无植物时C.pusillum没有主导菌群。因此，我们的主要观察确实依赖于玉米幼苗的存在。

A是在接种简化菌群和B不含阴沟肠杆菌群绝对定量各个时间点的菌量。可以看出群落变化的原因既包括了C的过度生长也包括了其他物种的消亡。
比较六个物种和7个物种的群落间距离，不含阴沟肠杆菌的距离比较大，其他的BC距离比较短，-Ppu普提达氏杆菌组中，15天的3颗玉米出现大的BC值也符合-Ppu和-Ecl在第15天聚类的结果，因此E是重组群落中最重要的物种，维持了7种物种的共存

除了研究玉米根系的模式群落装配外，还对其对寄主植物的潜在有益影响进行了评价。玉米幼苗枯萎病病原菌黄萎病菌
图1说明无菌和7个菌的菌群定殖的玉米在表型性状上没有观察到差异
A图：真菌-种子定殖实验，简化群落延迟了F.verticillioides黄萎病菌定殖，接种3天在两个对照中F.verticillioides黄萎病菌基本长满，在C7中，知道第四天F.verticillioides黄萎病菌才开始可见，知道第10天定殖差异才变得不显著。
B图：在C7组中F.verticillioides黄萎病菌定殖的少。
C图：玉米幼苗枯萎病的严重程度在C7实验组最轻。
D图：PDA和Agar上的C7对F.verticillioides黄萎病菌的抑制作用。
有视频显示抑菌作用，详见 https://www.pnas.org/content/suppl/2017/03/08/1616148114.DCSupplemental

A图：玉米幼苗枯萎病指数分级
B图：单菌的真菌-种子定殖实验
C图：单菌抑制实验7种菌都表现了对F.病原菌的抑制作用
体内实验上，E.cloacae阴沟肠杆菌表现出对F黄萎病菌的最高抑制，在幼苗接种第六天前其幼苗定殖率都低于对照组，比C7组早2天，疾病平均指数为60，显著低于对照，体外实验上，E表现出对F的最高抑制
结果表明：重组群落的7个成员对病原菌有抵抗作用，c7有很强的抵抗作用，这很符合多抗性假说，可能由于产生了生态位的竞争抑制了真菌侵染。
七种模式群落对F的延迟效应。左侧两粒种子表面均无细菌，其余两粒接种7种模式群落。实验进行了5天。
这种细菌抑制之真的研究，在之前报导的一篇Cell中有详细报导。见文末相关研究。

1 通过玉米宿主富集作用，作者得到了一个由7种细菌Enterobacter cloacae, Stenotrophomonas maltophilia, Ochrobactrum pituitosum, Herbaspirillum frisingense, Pseudomonas putida, Curtobacterium pusillum 以及Chryseobacterium indologenes组成的极简微生物组。

2 通过选择培养的方法跟踪每种菌的丰度，作者发现只有当 Enterobacter cloacae 菌株被移除时群落会完全解体，并且由Curtobacterium pusillum接管。这个结果表明E. cloacae在这个模型生态系统中发挥着keystone species的作用。

3 在体外以及植物实验中，作者发现人工重组微生物群落明显抑制真菌病原Fusarium verticillioides的定殖，对宿主有明显益处。

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