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胚胎期13.5小鼠生殖脊(全组织)的免疫荧光标记
实验目的:对生殖脊卵母细胞的免疫荧光标记(全组织染色),含EdU标记。如只标记抗体,可免去EdU相关步骤。
试剂耗材:
(1)固定液:4%多聚甲醛,-20/-80冻存(长期)或四度保存(一个月)。
(2)透膜液:PBS+0.1% 吐温+0.1% Triton X-100,过滤,4度或室温保存。
(3)封闭液:PBS+0.1% 吐温+1%BSA,过滤,四度保存。
(4)洗液:PBS+0.1% 吐温,过滤,4度或室温保存。
(5)封片剂:各类商业封片剂。
(6)抗体:一抗和二抗都用封闭液稀释。
(7)DNA染料:Hoechst33342。
(8)指甲油。
(9)载玻片/盖玻片:
(10)湿盒:暗盒加水。
(11)碧云天EdU click试剂盒。
实验样品:孕鼠(13.5dpc,11.5-17.5皆可,11.5之前的生殖脊分离较为困难,但也可用此法)。
实验步骤:
(1)EdU培养液培养生殖脊。
用细胞培养液(比如DMEM高糖+10%FBS+PS)配制10μM的EdU。加入24孔板的孔中备用(每孔200μL即可)。
生殖脊的分离。取孕鼠,分离胎鼠,分离生殖脊,减掉多余组织。
将生殖脊在EdU培养液中培养4h。
(2)固定:取出生殖脊,在24孔板的孔中固定(加200μL的4%多聚甲醛,可以直接在原来的孔中固定),室温1h。
(3)透膜:吸出甲醛,PBS洗2-3次(可省略),加0.3%的Triton,室温2小时。用PBS清洗3-5次,每次5min。
(4)按说明,配制EdU click反应液(事先分装好)。
(5)将生殖脊夹到载玻片上,用盖玻片尽力压扁,揭掉盖玻片,在组织周围用蜡笔或组化笔画圈,加入EdU click反应液。如果组织黏到盖玻片上,就在盖玻片上做下面的步骤。
(6)湿盒避光。用洗液清洗3次。加入封闭液,室温1-2小时(或四度过夜)。一抗孵育:用封闭液稀释一抗。去除封闭液,加一抗,孵育时间1-2天(至少四度过夜),洗液清洗3-5次。
(7)二抗孵育:用封闭液稀释二抗,湿盒避光,室温多于2小时。洗液清洗3-5次。
(8)Hoechst染核:大约1μg/mL为工作浓度,可进一步用洗液稀释。室温处理卵1-2h。
(9)封片:点加封片剂,盖上盖玻片,用指甲油封住。
(10)在载玻片上标记实验内容,日期。
不同种属的一抗可以混在一起孵育细胞。但是某些抗体不适合同时进行染色,比如Rad51和γH2A.X,此两者的抗体应该有竞争关系,有相关文献可查。
问题分析:
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GMT+8, 2024-10-19 22:15
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