小鼠体内成熟卵母细胞的体外受精及植入前胚胎培养

实验目的：主要目的为研究小鼠受精和胚胎发育。

试剂耗材：

          （1）M2操作液。

          （2）小鼠精子获能液HTF。

          （3）小鼠胚胎培养液（KSOM或M16或M2）。

          （4）剪刀、镊子、1mL注射器针头、石蜡油（胚胎培养级）等。

          （5）培养皿/口吸管/台式显微镜等。

实验样品：小鼠（雌性6-8周，雄性8周以上）。

实验步骤：

          按：植入前胚胎，是合子到囊胚阶段的胚胎，包括孵化的囊胚。

              早期胚胎，一般指合子到致密化的胚胎，是处于卵裂中的胚胎。

              合子，也可称为受精卵。

              体外受精后的卵母细胞可以称为合子，也可称为受精卵。

              孤雌激活后的卵母细胞，可称为孤雌激活的卵，1细胞胚胎（1-cell embryo）或卵（egg）。

          （1）第一天：制定实验计划。雌性小鼠超排，PMSG 每只小鼠10IU（一般为0.1-0.2mL，一般选择在晚上7:00）。

          （2）第三天：在PMSG注射后的46-48小时，注射hCG，每只小鼠10IU（如果为ICR小鼠，建议在PMSG后48小时注射）。

          （3）第四天：以PMSG晚上7:00注射为例，早上8:30-9:00，准备获能液，受精液和胚胎培养液。

              获能液：在3.5cm培养皿中，做80μL的HTF滴两个，位置在皿的边缘。覆盖石蜡油。

               受精液：在3.5cm培养皿中做尽可能多的40μL的受精滴（HTF），覆盖石蜡油。

              胚胎培养液：有两种选择，（1）做40μL的滴，覆盖石蜡油；（2）用4孔板或24孔板，加入1mL的胚胎培养液（不需覆盖石蜡油）。推荐第二种方式。

          （4）三种液滴准备完之后，杀雄鼠，取附睾尾，将附睾尾上的脂肪用滤纸吸掉，放入获能液皿的石蜡油中，将附睾尾剪破，精子挤出到石蜡油中。将无杂质的精子悬液用镊子推到获能液滴中，摇晃均匀。37度获能1小时。（此过程尽量不要拖延，如果有热台，建议使用）

          （5）在获能30-40分钟时，杀雌鼠，取输卵管到M2操作液中，取完后，将输卵管放入一个受精滴中。

          （6）将COC从小鼠输卵管壶腹部取出（用镊子夹住壶腹部两侧，用一次性1mL注射器针头刺破壶腹部，挤出COC）。COC留在受精滴中，输卵管丢弃。用10μL移液器将COC在受精滴中洗净（即去除组织碎片），放入一个或多个新的受精滴中。

          （7）用2.5μL移液器或口吸管向含有COC的受精滴中吹入获能精子（无需太多，以覆盖COC团块为限）。将受精皿放回培养箱。此步骤在10:00左右完成，不可拖延。

          （8）14:00-15:00，取出受精皿，用口吸管将COC的卵丘细胞和精子吹落。清洗卵子，放入新的受精滴（此时透明带上应尽量不黏连精子）。

          （9）17:00-18:00，取出受精皿，观察原核形成率，记录。将受精卵移入胚胎培养液中。

          （10）第五天：上午观察2-cell率。第六天：上午观察4-cell胚胎。第七天：上午、中午或下午观察桑椹胚与囊胚。如需出腔囊胚，可延至晚上或第八日。

问题分析：

          （1）COC的卵丘细胞可以用透明质酸酶去掉，但不知道去与不去对胚胎有何影响。

          （2）体外成熟的COC的体外受精，方法与此类似，可相互参考。

          （3）体外成熟的裸卵的体外受精，需摸索酸性台式液消化透明带的程度。