卵母细胞、COC和植入前胚胎的免疫荧光标记

实验目的：对卵母细胞、COC和植入前胚胎中的蛋白、细胞骨架、细胞器、DNA、RNA等的定位分析。

试剂耗材：

          （1）固定液：4%多聚甲醛，-20/-80冻存（长期）或四度保存（一个月）。

          （2）透膜液：PBS+0.1% 吐温+0.1% Triton X-100，过滤，4度或室温保存。

          （3）封闭液：PBS+0.1% 吐温+1%BSA，过滤，四度保存。

          （4）洗液：PBS+0.1% 吐温，过滤，4度或室温保存。

          （5）封片剂：Dabco封片剂（0.25g DABCO，9mL甘油，0.5mL 1M Tris pH8.0，0.5mL 超纯水）；或者各类商业封片剂（当标记囊胚时，由于渗透压问题，封片剂会导致囊胚皱缩，当注意）。

          （6）抗体：一抗和二抗都用封闭液稀释。

          （7）DNA染料：Hoechst33342，Hoechst33258，PI，DAPI。

          （8）羊毛脂：不可用指甲油。

          （9）载玻片/盖玻片：

          （10）湿盒：暗盒加水。

          （11）培养皿/口吸管/台式显微镜等

实验样品：小鼠/人的卵母细胞、COC或早期胚胎等（以卵母细胞为例）。

实验步骤：

          （1）固定：用40-50μL固定液做滴，将卵吹入，室温30分钟（或四度过夜）。

          （2）透膜：用40μL透膜液做滴，将卵从固定液中吸出，吹入透膜液中。放于湿盒，室温30分钟（或四度过夜）。

          （特殊处理，当标记DNA各类修饰时）：4M HCl（用PBS稀释即可），室温40分钟；0.1M Tris pH8.0 处理30分钟，洗液清洗一次（40-50μL做滴，将卵吹入，室温5分钟）。盐酸处理可将DNA修饰暴露出来，Tris处理，可将盐酸中和。

          （3）封闭：用40μL封闭液做滴，将卵吹入，室温1小时（或四度过夜）。

          （4）一抗孵育：用封闭液稀释一抗，40-50μL做滴，将卵吹入，湿盒4度过夜。

          （5）洗液清洗3-5次。

          （6）二抗孵育：用封闭液稀释二抗，40-50μL做滴，将卵吹入，湿盒避光，室温2小时。

          （7）洗液清洗3-5次。

          （8）Hoechst染核：大约1μg/mL为工作浓度，可进一步用洗液稀释。室温处理卵30分钟。

          （9）封片：将羊毛脂点于盖玻片的四角。将Dabco封片剂滴到载玻片上（用200μL枪头点），将卵吹入，尽量少加液体。用盖玻片封住封片剂。不可用力压。

          （10）在载玻片上标记实验内容，日期。

问题分析：

          （1）假阳性杂点如何处理？

          （2）透明带非特异性着色如何处理？

          （3）**如何分辨抗体是否为特异性标记？