分离肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）是建立过继性T细胞（adoptive T-cell therapy, ACT）治疗的基本操作程序，也是研究TILs抗肿瘤免疫反应的必经途径。机械方法是解离肿瘤组织，从切除的肿瘤中产成单细胞悬液的有效方案。然后用 Ficoll-Paque 密度梯度离心法分离TILs。这种方案适用于人类肿瘤组织和动物实验性肿瘤中的TILs细胞的提取。 

人体肿瘤标本和实验性肿瘤标本，通常采用机械解离肿瘤组织或消化酶降解肿瘤组织的方法，来提取和制备单个核细胞悬浮液。肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和其他单个核细胞是用Ficoll-Paque密度梯度离心法纯化。肿瘤解离主要包括酶解消化（如：collagenase, trypsin, dispase等），机械破坏瘤组织基质或两种方法相结合。从肿瘤组织中解离免疫细胞的主要考虑因素是，如何保持 TILs 的活力、功能和表型。虽然肿瘤组织的机械解离可能更加耗时，但这种方法的可重复性很高。使用消化酶解法可能会提高细胞的产率、但在不同的肿瘤组织和肿瘤模型中，需要仔细优化消化酶组成成分和浓度，以保留TIL表型，因为消化酶可能会减少淋巴细胞表面标志物的表达。

 TILs分离先决条件是需要新鲜的肿瘤样本；此外，新鲜肿瘤样本需要水化，放入磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液或培养基中。肿瘤样本脱水会大大降低TILs的产率和活力。 

Reagents  

1. 70% (v/v) ethanol in sterile water （70%酒精）

2. 1X PBS, pH 7.4 formulated without calcium and magnesium （生理盐水）

3. RPMI-1640 （1640培养基）

4. Fetal bovine serum (FBS) or human AB serum （胎牛血清或人AB血清）

5. 100x Penicillin-streptomycin (10,000 units/ml of penicillin and 10,000μg/ml of streptomycin)

  （双抗）

6. Ficoll-Paque PLUS （淋巴细胞分离液）

7. Dimethyl sulfoxide (DMSO) （二甲基亚砜）

8. Complete RPMI media: RPMI-1640 with 10% FBS or AB serum and 1x

9. Penicillin/streptomycin （1640完全培养基） 

Supplies and Equipment  

1. Sterile dissecting forceps and scissors （无菌钳和剪刀）

2. Single-edge razor blades （刀片）

3. Tissue culture hood  （生物安全柜）

4. Examination gloves  （无菌手套）

5. Sterile 50ml conical tubes 6. （50ml 无菌试管）

6. 5ml,10ml,25ml sterile serological pipets （5ml, 10ml, 25ml无菌吸管）

7. Pipet aid with speed settings  （自动移液器）

8. 1ml sterile pipette tips  （1ml 无菌吸头）

9. 100mm sterile petri dishes  （100mm 无菌培养皿）

10. Syringes with rubber plungers （注射器）

11. Sterile 70μm cell strainers  （70μm 无菌细胞网）

12. Weighing scale（称量天平）

13. Centrifuge with swing-bucket rotors  （水平转子离心机）

14. 2ml screw cap cryovials （2ml 冻存管）

15. Freezing containers  （冻存缸） 

机械方法分离肿瘤组织获取单细胞悬液 

1. 用无菌镊子，将切除的人肿瘤标本放置于含有5ml室温RPMI-1640培养基的无菌100mm培养皿盖上。一旦提取肿瘤，需将其放置在培养基中以防止脱水和TILs的损失。 

2. 将肿瘤用两个单刃刮刀剁碎成小块。为获得1-2mm大小的碎片，可用一只手拿着两个单刃刮刀来剁碎肿瘤。虽然这一步骤可能需要耗费时间，但对于确保切碎所有组织非常关键。 

3. 将一个70μm的细胞过滤器放在100mm培养皿的另一半上面。 

4. 用剃刀片切割一个1ml的移液管头。用这个切割的移液管头，将肿瘤组织转移到细胞过滤器上。如果盖子上有组织残留，加入另外5ml的RPMI-1640培养基，并将其转移到细胞过滤器上。

5. 使用注射器的橡胶柱塞将组织压碎通过细胞过滤器。由于细胞的解离培养皿中的培养基会变浑浊。小块组织会留在过滤器上。 

6. 将一个新的70μm细胞过滤器放在一个带有标签的无菌50ml圆锥管上面。

7. 将细胞悬液通过过滤器。在培养皿中加入更多的RPMI-1640培养液，并上下抽吸多次，重新悬浮所有剩余细胞。将培养皿中的剩余培养液通过过滤器。 

8. 用室温的RPMI-1640培养基将管中培养液补满至30ml。将样品置于18ºC-20ºC的室温下 

单个核细胞分离

1. 在叠加 Ficoll-Paque 分离液前，用 25 毫升移液器混匀单个核细胞悬液。确保细胞不会在底部沉淀或形成团块。

2. 倒转容器彻底混合 Ficoll-Paque 分离液。

3. 将移液器速度设为慢速释放。移取10毫升Ficoll-Paque分离液，小心地将移液管插入盛有30ml单细胞悬液的50ml锥形管底部。

4. 缓慢释放 Ficoll-Paque分离液，在细胞悬液下方形成Ficoll-Paque层。避免两种溶液混合。可见Ficoll-Paque和细胞悬液之间有明显的分隔。

5. 称量和配平样品试管和平衡管，以确保离心机转子平衡。

6. 在 20ºC 以下，1025g 离心 20 分钟，设定缓慢加速并关闭制动器。

7. 小心地将试管从转子适配器上取下，避免使离心产生的分层搅动，用移液管吸取20ml上清液置废液瓶。

8. 用无菌移液管将单个核细胞层和Ficoll Paque层之上的其余培养基一起转移到标记的50ml无菌锥形管中,尽可能减少混入Ficoll-Paque。 

清洗分离出的TILs 

1.  在 50 ml无菌锥形管中加入40ml完全 RPMI 培养基，用25ml移液管轻轻混匀。

2.  在 20ºC 下, 650 g, 离心10分钟。

3.  去除上清液，将细胞轻轻重新悬浮于30ml RPMI完全培养基中。

4.  在 20ºC 下，650 g，离心10分钟。

5.  取出上清液，并根据下游应用需要，重新悬浮细胞。 

注意事项说明 

1. Ficoll-Paque分离液的密度与温度成反比。影响温度的因素包括单个核细胞悬液、Ficoll-Paque分离液和离心机的温度，温度可能影响密度梯度分离得到的单个核细胞的产率。 因此，必须确保所有使用的培养基都已预热到18ºC-20ºC 的室温，并在18ºC-20ºC的温度下进行离心。

2. 获取肿瘤组织后，所有后续步骤均需在生物安全柜中进行，以尽量减少污染。

3. 切碎肿瘤时，使用不含任何FBS的RPMI-1640培养基。这是为了防止FBS导致细胞凝集。密度梯度离心后，使用RPMI完全培养基清洗细胞。

4. 温度过高可能会影响细胞活力，可将装有细胞悬液的试管短暂放置于冰上的试管架。

5. 注意保持Ficoll-Paque分离液避光，因为其中所含二苯甲酸钠对光敏感，避光有助于维持最佳密度。此外需要保持分离液无菌。

6. 在启动离心机之前，确保转子平衡，因为不平衡引起的振动可能导致细胞层与Ficoll-Paque层混合，因此降低细胞产率和纯度。离心前可使用平衡管称重配平。

7. 细胞洗涤步骤有助于去除混入的Ficoll-Paque，而得到高度纯化和有活力的淋巴细胞用于下游分析操作或大规模体外扩增。

8. 如果细胞需要冷冻以备将来使用，则将细胞重悬于新鲜制备的冷冻培养基中。

9. 如果需要冻存细胞以备将来使用，需将细胞重悬于新鲜配制的含有90% FBS和10% DMSO的冷冻保存液中，每个细胞标本中加入1ml冷冻保存液,然后转移到标记的无菌冻存管中。冻存管在液氮中保存之前，置入-80ºC的冷冻容器中（如装有新鲜异丙醇的冷冻缸），并在-80ºC低温冰箱中保存过夜。