一、产品简介：

果胶酯酶（pectinesterase），属果胶酶系，亦称果胶甲酯酶、果胶氧化酶。催化水解果胶长链上的甲氧酯水解产生小分子物质果胶酸和甲醇, 从而增加果胶在水中的溶解度。广泛存在于高等植物和可以降解细胞壁的细菌和真菌中，起内源调控植物细胞壁上及细胞之间果胶含量的作用。

果胶酯酶（PE）催化水解果胶分子释放H⁺，使反应体系的pH下降，用碱液维持体系的pH始终保持在7.8(酚酞指示剂维持在粉红色)，通过碱消耗的NaOH 量反映果胶酯酶的活性。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

天平、研钵/匀浆器、台式离心机、恒温水浴锅或恒温培养箱、冰、蒸馏水。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：取0.5g 组织样品（叶片类样本可取0.15g），加1.5mL 提取液冰浴研磨，12000rpm，4℃离心15min，取全部上清液置于冰上待测。

② 细菌/培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1.5mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。

2、预实验上机操作：

① 试剂一于37℃烘箱保温10min。

② 取出1mL的上清液转移至10ml离心管或试管中。

③ 向离心管或试管中依次加25μL 试剂二，4mL试剂一，混匀，并用试剂三调pH至7.8（粉红色）。

④ 将离心管或试管于37℃（水浴锅或恒温培养箱）孵育60min。每隔20分钟用试剂四调节pH，使其维持在7.8（粉红色）。同时记录所消耗的试剂四的体积V2（mL）。

3、正式实验：

① 若酶活力太高，可降低样本取样质量W或将待测样本适当稀释后再进行测定，并将改变后的D和W代入公式计算；

② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。

五、结果计算：

1、按照样本质量计算：

酶活定义：每g组织每小时消耗1μmol NaOH 定义为一个酶活单位(U)。

PE 活性(U/g)=20×V2÷(V1÷V×W) ÷T×D =30×V2÷W×D

2、按照蛋白浓度计算：

酶活定义：每mg蛋白每小时消耗1μmol NaOH 定义为一个酶活单位(U)。

PE 活性(U/mg prot)=20×V2÷(V1÷V×Cpr)÷T×D =30×V2÷Cpr×D

3、按细菌/细胞密度计算：

酶活定义：每10⁴个细菌或细胞每小时消耗1μmol NaOH 定义为一个酶活单位(U)。

PE 活性(U/10⁴ cell)=20×V2÷(V1÷V×细胞数量)÷T×D =30×V2÷细胞数量×D

V1：加入离心管或试管中的上清液体积，1mL；   V：提取液体积，1.5mL；  

V2：滴定所消耗的试剂四的量，mL；            T：反应时间，1h；

D：稀释倍数，未稀释即为1；                   W：样品质量，g；

细胞数量：以万计；                         Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL）。