在生物学的广阔天地里，糖类不仅仅是能量的源泉，更是调控生命活动的关键分子。海藻糖，由两个葡萄糖分子通过α-1,1糖苷键连接而成的非还原性二糖，广泛存在于动植物、微生物细胞中。它不仅作为能量储备物质，还在逆境条件下为生物体提供保护，增强细胞对环境变化的适应性。而海藻糖-6-磷酸（T6P），作为海藻糖的磷酸化衍生物，更是植物响应碳元素可用性、调控生长发育的关键信号分子。T6P的产生和降解过程受到精确调节，以确保生物体在环境和营养变化下保持最佳状态。

如何高效、精准地检测这些重要的生物分子呢？液质检测技术为我们提供了答案。液质检测，即液相色谱-质谱联用检测，是一种将液相色谱与质谱相结合的分析技术，适用于复杂有机混合物的分离和鉴定。液质联用技术，充分发挥了两种系统的优势。通过液相色谱的分离作用，将混合物中的各种成分进行有效分离；再经过质谱技术的离子化解析和电场电压调节，实现对指定荷质比成分的精准检测。这一技术不仅灵敏度高，而且能够提供被测物质的分子结构信息，为科学研究提供了有力支持。

一、样品准备

样品收集：根据实验目的，从生物体、组织、细胞或溶液中提取目标化合物，如海藻糖、海藻糖-6-磷酸等。

样品处理：对提取的样品进行必要的预处理，如过滤、离心、浓缩等，以去除杂质并富集目标化合物。

溶剂选择：选择合适的溶剂溶解样品，确保样品在液相色谱中的良好溶解性和分离效果。

二、仪器设置与校准

仪器检查：检查液相色谱仪和质谱仪的各部分是否正常工作，包括泵、进样器、色谱柱、检测器等。

仪器校准：使用标准品对仪器进行校准，确保色谱柱的分离效果和质谱仪的灵敏度、分辨率等参数满足实验要求。

方法开发：根据目标化合物的性质，选择合适的色谱柱、流动相、梯度洗脱程序、质谱检测条件等，开发适合的检测方法。

三、样品分析

进样：将处理好的样品注入液相色谱仪中，通过色谱柱进行分离。

色谱分离：在色谱柱中，样品中的不同成分根据其在流动相和固定相之间的分配系数进行分离。液相条件主要包括色谱柱、流动相、洗脱梯度、流速 。

质谱检测：分离后的成分进入质谱仪，经过离子化、质量筛选和检测等步骤，得到各成分的质谱图。质谱条件主要包括：电喷雾离子源、温度、离子源气体 I 、气体 II 、气帘气、碰撞诱导电离 。在三重四极杆（Qtrap）中，每个离子对是根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。

数据分析：根据质谱图，结合标准品的质谱数据，对样品中的目标化合物进行定性和定量分析。

四、结果处理

4.1样本数据分析

利用软件处理质谱数据。下图所示为标准品的总离子流图（Total ions current，TIC，即每个时间点质谱图中所有离子的强度加和后连续描绘得到的图谱）及MRM代谢物检测多峰图（多物质提取的离子流谱图，XIC），横坐标为代谢物检测的保留时间（Retention time，Rt），纵坐标为离子检测的离子流强度（强度单位为cps，count per second）。结果如下图：

图1:标品总离子流图（N代表负离子模式，P代表正离子模式）

图2：标准品MRM峰图（N代表负离子模式，P代表正离子模式）

用软件打开样本下机质谱文件，进行色谱峰的积分和校正工作，每个色谱峰的峰面积（Area）代表对应物质的相对含量，最后导出所有色谱峰面积积分数据保存。为了比较所有检测到的代谢物中每个代谢物在不同样本中的物质含量差异，根据代谢物保留时间与峰型的信息，我们对每个代谢物在不同样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。下图展示了随机抽取的代谢物在不同样本中的定量分析积分校正结果，横坐标为代谢物检测的保留时间(min)，纵坐标为某代谢物离子检测的离子流强度（cps）。

图3:积分校正图

4.2样本质控分析

质控样本（QC）由本次所检测物质标准品混合制备而成，用于分析样本在相同的处理方法下的重复性。在本次实验分析的过程中，每10个样本插入一个质控样本，以监测分析过程的重复性。

通过对不同质控QC样本质谱检测分析的总离子流图（TIC图）进行重叠展示分析，可以判断代谢物提取和检测的重复性，即技术重复。仪器的高稳定性为数据的重复性和可靠性提供了重要的保障。

图4: QC样本质谱检测TIC重叠图

4.3 标准曲线

标品浓度（Concentration）为横坐标，峰面积（Area）为纵坐标，绘制不同物质的标准曲线。

4.4 样本含量将检测到的所有样本的积分峰面积代入标准曲线线性方程进行计算，进一步带入计算公式计算后，最终得到实际样本中该物质的绝对含量数据。

样本中代谢物的含量（ng/g）= c*V/m

公式中各字母含义：c：样本中积分峰面积代入标准曲线得到的浓度值（ng/mL）；V：提取时所用溶液的体积（ml）；m：称取的样本质量（g）。

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