一、产品简介：

多聚半乳糖醛酸酶（ploygalacturonase，PG）是一种细胞壁结合蛋白，可以催化果胶分子中 α-(1,4)-聚半乳糖醛酸的裂解，参与果胶的降解，使细胞壁结构解体，导致果实软化，与果实成熟、叶和花的脱落、病原物防御，细胞伸展发育以及木质化有关，在植物抗病性和食品贮藏保鲜领域具有较高的研究价值。

果胶在多聚半乳糖醛酸酶(PG)作用下，能水解产生具有还原性醛基的半乳糖醛酸。与DNS试剂反应生成红棕色物质，在540nm有特征吸收峰，测定540nm处吸光值变化可计算得多聚半乳糖醛酸酶活性。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、冰和蒸馏水。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取约0.1g组织，加入1mL提取液冰浴匀浆；16000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；16000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴）：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取。

③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。

2、标准溶液的配制：把20μmol/mL标准品母液用蒸馏水稀释成12、10、8、6、4、2μmol/mL的标准溶液备用。

3、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm。

② 操作表：

4、正式实验：

① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围：高于最高值建议将待测样本适当稀释后再进行测定，低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定，并将改变后的W代入公式计算；

② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行（标准管和空白管预实验已做，正式实验可选做）。

五、结果计算：

1、以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA测定带入方程得到x（μmol/mL）。

2、PG酶活的计算：

①按样本蛋白浓度计算：

酶活定义：在40℃，pH 4.6的条件下，每mg蛋白每小时分解多聚半乳糖醛酸产生 1 μmol 的半乳糖醛酸定义为一个酶活力单位（U）。

PG活性（U/mg prot）= x÷Cpr÷T = 0.5×x÷Cpr

②按样本质量计算：

酶活定义：在40℃，pH 4.6的条件下，每g样本每小时分解多聚半乳糖醛酸产生 1 μmol 的半乳糖醛酸定义为一个酶活力单位（U）。

PG活性（U/g 质量）= x×V÷W÷T = 0.5×x÷W

③按细菌数量计算：

酶活定义：在40℃，pH 4.6的条件下，每10⁴个细菌每小时分解多聚半乳糖醛酸产生 1 μmol 的半乳糖醛酸定义为一个酶活力单位（U）。

PG活性（U/10⁴ cell）= x×V÷T÷细菌数量=0.5×x÷细菌数量

④按液体体积计算：

酶活定义：在40℃，pH 4.6的条件下，每mL样本每小时分解多聚半乳糖醛酸产生 1 μmol 的半乳糖醛酸定义为一个酶活力单位（U）。

PG活性（U/mL）= x÷T = 0.5×x

V：加入提取液体积，1 mL；              Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；

W：样本质量，g；                       T：反应时间，2h。