一、产品简介：

蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中，酸性蛋白酶（ACP）是在酸性条件下将酪蛋白水解产生酪氨酸；酪氨酸与福林酚在碱性条件下反应生成蓝色化合物；该蓝色物质在680nm有特征吸收峰，进而得酸性蛋白酶活性。

酸性条件下，ACP催化酪蛋白水解产生酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，通过测定其吸光度增加，来计算ACP活性。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

组织样本：称取0.1g样本，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

2、标准溶液的配制：把100μg/mL标准品母液用蒸馏水稀释成100、80、60、40、20、10μg/mL的标准溶液备用。

3、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至680nm。

② 试剂一、试剂二和试剂三置于30℃水浴保温30min以上。

③ 操作表：

4、正式实验：

① 若（A测定-A对照）差值较小，可适当延长第一步水浴时间20-30min，并将改变后的T代入公式计算；

② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行（标准管和空白管预实验已做，正式实验可选做）。

五、结果计算：

1、以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA测定带入方程得到x（μg/mL）。

2、按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：40℃每mg蛋白每分钟催化水解产生1μg酪氨酸为一个酶活单位（U）。

ACP活性(U/mg prot)=x×V2÷(Cpr×V1)÷T×D =0.5×x÷Cpr×D

3、按照样本质量计算：

酶活单位定义：40℃每g样品每分钟催化水解产生1μg酪氨酸为1个酶活单位（U）。

ACP活性(U/g 质量)=x×V2÷(W×V1÷V)÷T÷W×D=0.5×x÷W×D

V：加入提取液体积，1mL；           V1：反应中样本体积，0.02mL；

T：反应时间，10min；                V2：酶促反应总体积，100μL=0.1mL；

W：样本质量，g；                    D：稀释倍数，未稀释即为1；

Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。