酶联免疫Elisa是利用酶标记的抗原或抗体，在固相载体上进行的抗原或抗体的测定。

基本方法有：直接法、间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。在医学，动物和植物等研究方面应用广泛，今天总结下样品的收集和要求。

组织样品匀浆原则

1，对于样本要求保持鲜重

2，称取样本中的重量不小于50mg，一般以0.1～0.5g；

3，匀浆的比例选取10%，相当于1g组织加9ml的匀浆液来进行匀浆。

4，匀浆液选取PBS（PH=7.2-7.4，浓度为0.01mol/L）

5，匀浆过程选用组织匀浆器，冰浴上匀浆。(或者进行液氮碾磨)

6，离心取上清，离心转速选用5000转每分，时间是15分钟。取上清液待检！

血液样品

一、液体样本

液体样本处理原则:所有的液体样本，用无菌管收集，2-8°℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分)，如果以后碰到其他的液体样本，也按这个方法，纳入汇总表。

样品量：每个指标需要50ul样品量，小鼠大鼠的动物血清样本量比较少，所以一般情况下会血清不够做一定比例的稀释，最少每个指标每样准备10ul稀释5倍(建议每样寄12-15ul,会有挂壁损耗)。

1、血清:用无菌管收集，室温血液自然凝固10-20分钟，2-8℃。条件离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2、血浆:应根据标本的要求选择EDTA、肝素钠或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3、尿液:用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

4、胸腹水:用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分),仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5、脑脊液:用无菌管收集，2-8°℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

6、唾液:用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

7、细胞培养上清:检测分泌性的成份时，用无菌管收集。2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清;保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

8、牛奶:用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

9、蜂蜜:用无菌管收集，2-8℃条件离心20分钟左右(2000-3000转/分)，仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

10、全血:用含有抗凝剂的无菌管收集，立即轻轻摇动，来回轻轻颠倒数次，使血液和抗凝剂混匀，以防血液凝固。

11.注意事项：血清是检体中最常见样本，如抗体、生化、激素、血药浓度等项目均需要用到血清，然而其质量确实是不可忽视的问题，溶血、脂血、黄疸都会一定程度上影响检测结果

（1） 全血采集

量约为要求血清量的2-2.5倍（如：血清要求1ml，需采集全血2-2.5ml）

（2）血清分离

全血存放的容器决定分离的是血清还是血浆；促凝管和空白管存放全血经血液凝固后离心分出的上清是血清；若放入EDTA抗凝管或者肝素抗凝管，离心后分出的上清称为血浆（如图）

备注：血清主要区别于血浆的是有血液凝固的过程和纤维蛋白的析出.

（3） 血浆是否可以替代血清进行送检？

多数项目中血浆样本可以替代血清，前提是该检测项目不受抗凝剂成分和凝血因子的影响（如抗体类项目），但生化项目则不可用EDTA抗凝分离血浆，因为EDTA-2K此种抗凝剂不仅可以络合重金属Mg2+，也会致使K+的含量上升，故生化项目的最佳样本是血清。

（4）什么样的血清样本不合格？

溶血、脂血（乳糜血）、黄疸（若是病理性原因很难消除）属于不合格的样本（如图）

（5）血清质量是怎样影响检测的？

溶血：红细胞的破裂会引起血浆成分的改变，对一些生化项目如谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、钾的测定结果造成较大的影响。若进行抗体类检测本身血清的颜色会干扰到最终的酶标仪读数。

脂血：在运用比色法和比浊法检测的项目中，脂血中的乳糜微粒具有散射光的特性不能通过双波长进行消除从而影响检测结果。

黄疸：黄疸的血清中含有胆红素，若样本放置时间过长或通过氧化剂后胆红素还可被氧化为胆绿素、胆褐素，这些色素在不同波长范围具有一定的光吸收，从而影响检验结果。

细胞样品：

1、贴壁细胞用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5分钟后收集细胞；悬浮细 胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每 1×106 个细胞中加入150-200μL PBS重悬并通过反 复冻融使细胞破碎(若含量很低可减少PBS的体积)。将提取液于1500×g离心10分钟，取上清检测。

2、超声波破碎条件：用20kHz频率，150W的功率，在冰浴中进行超声波破碎，每破碎2s，间隔3s，反复破碎三次。

3、反复冻融：收集细胞悬液，4℃低温离心（3000rpm，5min），弃上清，加入一定量PBS（200ul），轻轻吹打混匀，-20℃冷冻30 min，37℃解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。

培养好的板子，贴壁细胞，消化下来，放进无菌管寄出

六孔板养后用胰酶消化后加200ul PBS重悬 用液氮冻存下干冰寄出。

土壤样本处理

一般分为2个步骤：第一个步骤是测定含水率，第二个步骤是进行匀浆，按照10%混匀离心取上清待检。具体操作如下。

第一部分：

1，称取土壤500mg左右，必须保持鲜重，按照重量和体积比加入1:10的PBS溶液（PBS的浓度为0.01mol/L,PH控制在7.2-7.4），例如称取的是0.5g加入5ml的PBS，称取的重量不要求保持一致，但匀浆的比例都是按照1:10的关系来。

2，进行涡旋震荡，充分混匀，涡旋时间30秒

3，离心取上清，离心转速为4000转每分，时间为15分钟左右，取上清液待检

第二部分：（不需要含水量也可以不用做）

称取500mg左右的样本，进行烘干，前后称取重量，测定含水率。（这个是为后期剔除掉含水率）