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一、产品简介:
土壤蔗糖酶(S-SC)能够将蔗糖水解为相应的单糖而被机体吸收,其酶促作用产物与土壤中有机质、氮、磷含量、微生物数量及土壤呼吸强度密切相关,可作为评价土壤肥力的重要指标。
土壤蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3, 5- 二硝基水杨酸反应而生成棕红色氨基化合物。颜色深度与还原糖量相关,因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 自备 | 4℃保存 | 甲苯 |
试剂二 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 | 临用前加入 15 mL 蒸馏水充分溶解备用,用不完的试剂4℃保存 2 周。 |
试剂四 | 液体22mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1mL蒸馏水,充分溶解后,-20℃保存(即为10mg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵、天平、可调式移液器、30-50目筛、甲苯和蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
新鲜土样自然风干或37℃烘箱风干,过30-50目筛。
【注】:土壤风干,减少土壤中水分对于实验的干扰;
2、标准溶液的配制:把10mg/mL标准品母液用蒸馏水稀释成0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05mg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
Sx | 10 | 450 | 50 | 1 |
S1 | 1 | 80 | 320 | 0.8 |
S2 | 1 | 80 | 120 | 0.6 |
S3 | 0.8 | 200 | 200 | 0.4 |
S4 | 0.4 | 200 | 200 | 0.2 |
S5 | 0.2 | 200 | 200 | 0.1 |
S6 | 0.1 | 200 | 200 | 0.05 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至540nm。
② 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
土样(g) | 0.04 | 0.04 | - | - |
试剂一 | 6 | 6 | - | - |
振荡混匀,使土样全部湿润,37℃静置15min。 | ||||
试剂二 | 100 | 100 | - | - |
试剂三 | 300 | - | - | - |
蒸馏水 | - | 300 | - | - |
① 充分混匀,放入37℃水浴锅或恒温培养箱中孵育24h后,于10000g,4℃离心5 min,取上清液; ② 将培养结束的上清液稀释10倍(取0.1mL上清液,加入0.9mL蒸馏水)。 | ||||
稀释后的上清液 | 80 | 80 | - | - |
标准溶液 | - | - | 80 | - |
蒸馏水 | - | - | - | 80 |
试剂四 | 200 | 200 | 200 | 200 |
充分混匀,沸水浴5min(可用封口膜缠紧,以防止水分散失),取出后流水冷却至室温。于540nm处读取吸光值A,分别记为A测定、A对照、A标准和A空白;计算∆A测定=A测定-A 对照,∆A标准=A标准-A空白。(注:每个样本需做一个自身对照,空白管只需做1-2次。) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将上清液用蒸馏水适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的W和D代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。
2、S-SC活力计算:
单位定义:每天每g土样中产生1mg还原糖定义为一个酶活力单位(U)。
S-SC活力(U/g土样)=x×V÷W÷T×D=4.06×x÷W
V:反应总体积,0.406mL; T:反应时间,24h=1d;
W:土壤样本实际取样量,g; D:稀释倍数,上述反应体系中为10。
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