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一、产品简介:
维生素 E(Vitamin E)是一种脂溶性维生素,其水解产物为生育酚,是生物体中最主要的抗氧化剂之一,能阻止不饱和脂肪酸收到过氧化作用的损伤,维持不饱和脂肪酸细胞膜的完整性和正常功能,具有延缓衰老、预防溶血性贫血作用,在医药、化妆品、保健品、食品行业具有较高的应用价值。 VE还原Fe3+为Fe2+,Fe2+与1,10-菲啰啉产生有色络合物,在530nm有特征吸收峰。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 自备 | 常温保存 | 无水乙醇 |
试剂二 | 自备 | 常温保存 | 正庚烷 |
试剂三 | 液体2.2mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 粉剂×1瓶 | 4℃保存 | 试剂四贮备液的制备:将试剂四的粉剂溶于 2 mL 无水乙醇配制成贮备液,2-8℃避光保存待用; 试剂四使用液的制备:取试剂四贮备液用无水乙醇 20 倍稀释后使用,建议当天配制当天使用。 |
试剂五 | 液体7 mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | -20℃保存 | 临用前加入 1 mL 试剂一,充分溶解(即2 mg/mL 标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、漩涡震荡仪、可调式移液器、无水乙醇、正庚烷、冰、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取约 0.1g 组织,加入200µL蒸馏水,再加入300µL试剂一和500µL试剂二,进行匀浆,匀浆后在旋涡混匀仪上震荡5min(充分抽提)。5000g,25℃离心 5min,取上层正庚烷抽提液 300µL 加入到 900µL 无水乙醇中(按照上层抽提液:无水乙醇=1:3)混匀待测。
② 血清(血浆)样本:取血清(血浆)200µL,加入200µL蒸馏水,再加入300µL试剂一和500µL试剂二,进行匀浆,匀浆后在旋涡混匀仪上震荡5min(充分抽提)。5000g,25℃离心 5min,取上层正庚烷抽提液 300µL 加入到 900µL 无水乙醇中(上层抽提液:无水乙醇=1:3)混匀待测。
2、标准溶液的配制:把2 mg/mL 的标准品母液用试剂一稀释成100、50、25、12.5、6.25、3.125 µg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
S1 | 2 | 950 | 50 | 0.1 |
S2 | 0.1 | 500 | 500 | 0.05 |
S3 | 0.05 | 500 | 500 | 0.025 |
S4 | 0.025 | 500 | 500 | 0.0125 |
S5 | 0.0125 | 500 | 500 | 0.00625 |
S6 | 0.00625 | 500 | 500 | 0.003125 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至530nm。
② 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 100 | 100 | - | - |
标准液 | - | - | 100 | - |
试剂一 | - | 20 | - | 120 |
试剂三 | 20 | 20 | 20 | 20 |
试剂四 | 20 | - | 20 | - |
充分混匀,立即记时,25℃反应5 min | ||||
试剂五 | 60 | 60 | 60 | 60 |
充分混匀,测定 530 nm 处吸光值,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。计算 ΔA测定=A测定-A 对照,ΔA 标准=A 标准-A 空白。(注:每个测定管需要一个对照管,空白管只需测定1-2次。) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用试剂一适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的D和W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(μg/mL)。
2、按样本质量计算:
VE含量(μg/g 质量) =x×4×V÷W=2x÷W
3、按血清(血浆)体积计算:
VE含量(μg/mL)=x×4×V÷V1=10x
4:待测样本为300µL的正庚烷抽提液加900µL的无水乙醇,相当于将抽提样本稀释4倍后检测;
V:提取过程加入正庚烷的体积,0.5mL;
V1:提取过程中加入血清(浆)体积,0.2mL;
W:样本质量,g。
注意事项:
1、离心后,在吸取上层正庚烷抽提液时,切勿将中间无水乙醇与水的液相层吸入,以免影响试验结果。
2、若反应体系产生沉淀,建议将待测样本用试剂一进行适当的稀释,并在计算公式中乘以稀释倍数。
3、比色皿需用无水乙醇冲洗,勿用蒸馏水以防出现分层影响试验数据。
4、显色结束后尽快完成测定。
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