一、产品简介：

谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px 或 GPX，EC.1.11.1.9）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。

GSH-Px 催化有机过氧化物氧化 GSH，产生 GSSG；谷胱甘肽还原酶（GR）催化 NADPH 还原 GSSG，再生 GSH，同时 NADPH 氧化生成 NADP⁺；NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰，而 NADP⁺没有；通过测定 340nm 光吸收减少速率来计算 GSH-Px 活性。

二、试剂盒的组成和配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔UV板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、超声细胞破碎仪、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取0.1g样本，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆，于8000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

② 细菌、真菌：取500万细胞，加入1mL试剂一，冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min）；然后于8000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。【注】：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。

③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清置于冰上待测。

2、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm。

② 操作表：

3、正式实验：

① 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

② 正式实验按照预实验上机操作步骤进行（空白管预实验已做，正式实验可选做）。

五、结果计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1、按组织蛋白浓度计算：

活性单位定义：37℃条件下，每 mg 蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位（U）。

GPX活性(U/mg prot)=(△A÷ε÷d×10⁹×V2)÷(Cpr×V1)÷T=107.2×△A÷Cpr

2、按组织样本质量计算：

活性单位定义：37℃条件下，每 g 组织每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位（U）。

GPX活性(U/g 质量)=(△A÷ε÷d×10⁹×V2)÷(W×V1÷V)÷T=107.2×△A÷W

3、按细胞数量计算：

活性单位定义：37℃条件下，每 10⁴ 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为一个酶活单位（U）。

GPX活性(U/10⁴ cell)=[△A÷ε÷d×V2×10⁹]÷(N×V1÷V)÷T=107.2×△A÷N

4、按液体体积计算

活性单位定义：37℃条件下，每mL液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为 1 个酶活单位（U）。

GPX活性(U/mL)=[△A÷ε÷d×V2×10⁹]÷V1÷T=107.2×△A

V：加入提取液体积，1mL；                  V1：反应中样本体积，100µL=0.1mL

V2：反应体系总体积，200 µL=2×10^-4L；       d：微量石英比色皿光径，1cm；

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；  T：反应时间，3min；

W：样品质量，g；                           D：稀释倍数，未稀释即为1；

N：细菌或细胞数量，以万计；                Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下:

1、按组织蛋白浓度计算：

活性单位定义：37℃条件下，每 mg 蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位（U）。

GPX活性(U/mg prot)=(△A÷ε÷d×10⁹×V2)÷(Cpr×V1)÷T=214.4×△A÷Cpr

5、按组织样本质量计算：

活性单位定义：37℃条件下，每 g 组织每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位（U）。

GPX活性(U/g 质量)=(△A÷ε÷d×10⁹×V2)÷(W×V1÷V)÷T=214.4×△A÷W

6、按细胞数量计算：

活性单位定义：37℃条件下，每 10⁴ 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为一个酶活单位（U）。

GPX活性(U/10⁴ cell)=[△A÷ε÷d×V2×10⁹]÷(N×V1÷V)÷T=214.4×△A÷N

7、按液体体积计算

活性单位定义：37℃条件下，每mL液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化定义为 1 个酶活单位（U）。

GPX活性(U/mL)=[△A÷ε÷d×V2×10⁹]÷V1÷T=214.4×△A

V：加入提取液体积，1mL；                  V1：反应中样本体积，100µL=0.1mL；

V2：反应体系总体积，200 µL=2×10^-4L；      d：96孔UV板光径，0.5cm；

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；T：反应时间，3min；

W：样品质量，g；                         D：稀释倍数，未稀释即为1；

N：细菌或细胞数量，以万计；              Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。

注意事项：

1、样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力；

2、工作液和底物液须临用前配制，配完后置于冰上，当天使用完；

3、若测定ΔA小于0.005，可延长反应时间至10min，计算时相应改变T。