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一、产品简介:
谷胱甘肽还原酶(GR)是维持细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)含量的主要黄素酶,作为谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一,能够催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原为还原型谷胱甘肽(GSH),有助于维持体内 GSH/GSSG 比值,在氧化胁迫反应和抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径中起着重要作用。
GR 能催化 NADPH 还原 GSSG 生成 GSH,同时 NADPH 脱氢生成 NADP+,NADPH 在 340 nm处具有特征吸收峰,通过吸光值的变化即可表征谷胱甘肽还原酶的活性。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体 120 mL×1 瓶 | 4℃保存 | - |
试剂二 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 | 使用前加入 2 mL 蒸馏水充分溶解(现用现配,配置完后置于冰上待用) |
试剂三 | 粉剂×1 瓶 | -20℃保存 | 使用前加入 3 mL 蒸馏水充分溶解(现用现配,配置完后置于冰上待用) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板(UV板)、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
组织样本:称取0.1g样本,加入1mL试剂一进行冰浴匀浆,10000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
2、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至340 nm。
② 试验前将试剂一置于 37℃中预热 30 min。
③ 操作表:
测定管 | 空白管 | |
试剂二 | 10 | 10 |
试剂三 | 20 | 20 |
试剂一 | 150 | 170 |
样本 | 20 | - |
迅速混匀并开始计时,记录第 10s 处 340nm 的吸光值,记为A1 测定、A1 空白,迅速置于 37℃水浴或培养箱 3min(酶标仪有控温功能的可以调节温度至 37℃),拿出迅速擦干测定 3min10s 时的吸光值,记为 A2测定、A2空白,计算ΔA =(A2 测定-A1 测定)-(A2 空白-A1 空白)。注:空白管只需测 1-2 次。 |
3、正式实验:
① 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
② 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。
五、结果计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
1、按样本质量计算:
活性单位定义:pH 8.0 条件下每 g 组织每分钟催化 1 µmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。
GR活性(U/g 质量)=(△A÷ε÷d×106×V2)÷(W×V1÷V)÷T=0.536×△A÷W
2、按样本蛋白浓度计算:
活性单位定义:pH 8.0 条件下每 mg 蛋白每分钟催化 1 µmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。
GR活性(U/mg prot)=(△A÷ε÷d×106×V2)÷(Cpr×V1)÷T=0.536×△A÷Cpr
V 1:反应体系中加入样本的体积,20 µL=0.02 mL; V :样本总体积,1 mL;
V 2:反应体系总体积,200 µL=2×10-4 L; d:比色皿光径,1 cm;
ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm; T:反应时间,3 min;
Cpr:粗酶液蛋白浓度,mg/mL; W:样本质量,g;
106:单位换算系数,1 mol=106 µmol。
b.用 96 孔板测定的计算公式如下:
1、按样本质量计算:
活性单位定义:pH 8.0 条件下每 g 组织每分钟催化 1 µmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。
GR活性(U/g 质量)=(△A÷ε÷d×106×V2)÷(W×V1÷V)÷T=1.072×△A÷W
3、按样本蛋白浓度计算:
活性单位定义:pH 8.0 条件下每 mg 蛋白每分钟催化 1 µmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。
GR活性(U/mg prot)=(△A÷ε÷d×106×V2)÷(Cpr×V1)÷T=1.072×△A÷Cpr
V 1:反应体系中加入样本的体积,20 µL=0.02 mL; V :样本总体积,1 mL;
V 2:反应体系总体积,200 µL=2×10-4 L; d:96孔 UV 板光径,0.5cm;
ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cm; T:反应时间,3 min;
Cpr:粗酶液蛋白浓度,mg/mL; W:样本质量,g;
106:单位换算系数,1 mol=106 µmol。
注意事项:
①样本处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力,匀浆液避免反复冻融;
②试剂一中含有一定浓度的蛋白(约 0.1 mg/mL),测定样品蛋白浓度时需减去本身的蛋白含量。
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