一、产品简介：

谷胱甘肽还原酶（GR）是维持细胞中还原型谷胱甘肽（GSH）含量的主要黄素酶，作为谷胱甘肽氧化还原循环的关键酶之一，能够催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原为还原型谷胱甘肽（GSH），有助于维持体内 GSH/GSSG 比值，在氧化胁迫反应和抗坏血酸-谷胱甘肽循环途径中起着重要作用。

GR 能催化 NADPH 还原 GSSG 生成 GSH，同时 NADPH 脱氢生成 NADP⁺，NADPH 在 340 nm处具有特征吸收峰，通过吸光值的变化即可表征谷胱甘肽还原酶的活性。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板（UV板）、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

组织样本：称取0.1g样本，加入1mL试剂一进行冰浴匀浆，10000rpm，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

2、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至340 nm。

② 试验前将试剂一置于 37℃中预热 30 min。

③ 操作表：

3、正式实验：

① 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

② 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。

五、结果计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1、按样本质量计算：

活性单位定义：pH 8.0 条件下每 g 组织每分钟催化 1 µmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。

GR活性(U/g 质量)=(△A÷ε÷d×10⁶×V2)÷(W×V1÷V)÷T=0.536×△A÷W

2、按样本蛋白浓度计算：

活性单位定义：pH 8.0 条件下每 mg 蛋白每分钟催化 1 µmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。

GR活性(U/mg prot)=(△A÷ε÷d×10⁶×V2)÷(Cpr×V1)÷T=0.536×△A÷Cpr

V 1：反应体系中加入样本的体积，20 µL=0.02 mL；     V ：样本总体积，1 mL；

V 2：反应体系总体积，200 µL=2×10^-4 L；              d：比色皿光径，1 cm；

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；        T：反应时间，3 min；

Cpr：粗酶液蛋白浓度，mg/mL；                      W：样本质量，g；

10⁶：单位换算系数，1 mol=10⁶ µmol。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下:

1、按样本质量计算：

活性单位定义：pH 8.0 条件下每 g 组织每分钟催化 1 µmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。

GR活性(U/g 质量)=(△A÷ε÷d×10⁶×V2)÷(W×V1÷V)÷T=1.072×△A÷W

3、按样本蛋白浓度计算：

活性单位定义：pH 8.0 条件下每 mg 蛋白每分钟催化 1 µmol NADPH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。

GR活性(U/mg prot)=(△A÷ε÷d×10⁶×V2)÷(Cpr×V1)÷T=1.072×△A÷Cpr

V 1：反应体系中加入样本的体积，20 µL=0.02 mL；     V ：样本总体积，1 mL；

V 2：反应体系总体积，200 µL=2×10^-4 L；                d：96孔 UV 板光径，0.5cm；

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；        T：反应时间，3 min；

Cpr：粗酶液蛋白浓度，mg/mL；                     W：样本质量，g；

10⁶：单位换算系数，1 mol=10⁶ µmol。

注意事项：

①样本处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；

②试剂一中含有一定浓度的蛋白（约 0.1 mg/mL），测定样品蛋白浓度时需减去本身的蛋白含量。