一、产品简介：

木质素过氧化物酶（LiP)是一系列含Fe³⁺、卟啉环和血红素辅基的同工酶，是木质素生物降解过程中的主要降解酶，能够在木素聚合物内形成自由基，导致键稳定变差从而破坏木质素大分子，在木质素生物降解、造纸工业、纺织工业、芳香化合物转化与降解及环境污染控制等方面具有重要应用。

藜芦醇可以被Lip催化发生氧化反应，其产物藜芦醛在310nm处有最大吸收峰，根据310nm处吸光度变化值可表征Lip的活性。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔UV板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：

称取约0.1g组织，加入1mL试剂一，进行冰浴匀浆；10000g，4℃离心10min，取上清置冰上待测。【注】：若增加样本，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5～10的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL试剂一，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；10000g，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为500～1000：1的比例进行提取。

2、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至310nm。

② 操作表：

4、正式实验：

① 若ΔA小于0.005，可以延长反应时间（由5min改为10min）或者增加样本量再进行测定，计算时相应修改；

② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。

五、结果计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1、 按样本蛋白质浓度计算

酶活定义：37℃，pH4.0条件下，每mg组织蛋白每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。

Lip活性（U/mg prot）=ΔA×V2÷(ɛ×d)×10⁹÷(V1×Cpr)÷T=215.1×ΔA÷Cpr

2、 按样本质量计算

酶活定义：37℃，pH4.0条件下，每g组织每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。

Lip活性（U/g质量）= ΔA×V2÷(ɛ×d)×10⁹÷(V1÷V ×W)÷T=215.1×ΔA÷W

3、 按细菌/细胞数量计算

酶活定义：37℃，pH4.0条件下，每10⁴细菌/细胞每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。

Lip活性（U/10⁴cell）=ΔA×V2÷(ɛ×d)×10⁹÷(V1÷V×细胞数量)÷T=215.1×ΔA÷细胞数量

4、 按照样本体积计算

酶活定义：37℃，pH4.0条件下，每mL血清或液体样本每分钟氧化1nmol藜芦醇所需酶量为一个酶活单位。

Lip活性（U/mL）=ΔA×V2÷(ɛ×d)×10⁹÷V1÷T=215.1×ΔA

ε：藜芦醛摩尔消光系数：9300L/mol/cm；           d：96孔UV板光径，1cm；

V2：反应总体积，2×10^-4L；                      V1：加入样本体积，0.02mL，

V：提取液体积，1mL；                          W：样本质量，g；

T：反应时间，5min；                              10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol；

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下:

1、 按样本蛋白质浓度计算

酶活定义：37℃，pH4.0条件下，每mg组织蛋白每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。

Lip活性（U/mg prot）=ΔA×V2÷(ɛ×d)×10⁹÷(V1×Cpr)÷T=430.1×ΔA÷Cpr

3、 按样本质量计算

酶活定义：37℃，pH4.0条件下，每g组织每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。

Lip活性（U/g质量）= ΔA×V2÷(ɛ×d)×10⁹÷(V1÷V ×W)÷T=430.1×ΔA÷W

3、 按细菌/细胞数量计算

酶活定义：37℃，pH4.0条件下，每10⁴细菌/细胞每分钟氧化1nmol藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位。

Lip活性（U/10⁴cell）=ΔA×V2÷(ɛ×d)×10⁹÷(V1÷V×细胞数量)÷T=430.1×ΔA÷细胞数量

4、 按照样本体积计算

酶活定义：37℃，pH4.0条件下，每mL血清或液体样本每分钟氧化1nmol藜芦醇所需酶量为一个酶活单位。

Lip活性（U/mL）=ΔA×V2÷(ɛ×d)×10⁹÷V1÷T=430.1×ΔA

ε：藜芦醛摩尔消光系数：9300L/mol/cm；           d：96孔UV板光径，0.5cm；

V2：反应总体积，2×10^-4L；                      V1：加入样本体积，0.02mL，

V：提取液体积，1mL；                          W：样本质量，g；

T：反应时间，5min；                              10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹nmol；

Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。