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一、产品简介:
黄烷醇(Flavanols)是一种天然植物化合物,存在于葡萄,可可、茶、红酒、果蔬等中,在可可,葡萄,猕猴桃中的黄烷醇倍认为是重要的营养品质之一。 实验采用DMACA-显色法测定总含量,即在DMACA与黄烷醇类化合物形成在 640nm 处有特征吸收峰的物质,测定反应产物在 640nm 处的吸光值,即可计算样品中总黄烷醇含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体17mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃避光保存 | 临用前加入2mL蒸馏水,充分溶解(即1mg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备:
① 组织样本:称取约0.1g新鲜样本(或者称取约0.01g烘干样本),加入1.0mL 提取液(若鲜样需研磨均质),置于60℃振荡提取2h。12000rpm,25℃离心10min,取上清待测。
② 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、标准溶液的配制:把1mg/mL标准品母液用蒸馏水稀释成0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.0015625 mg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
S1 | 1 | 950 | 50 | 0.05 |
S2 | 0.05 | 500 | 500 | 0.025 |
S3 | 0.025 | 500 | 500 | 0.0125 |
S4 | 0.0125 | 500 | 500 | 0.00625 |
S5 | 0.00625 | 500 | 500 | 0.003125 |
S6 | 0.003125 | 500 | 500 | 0.0015625 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min,调节波长至640nm。
② 操作表:
测定管 | 标准管 | 空白管 | |
样本 | 50 | - | - |
提取液 | - | - | 50 |
标准品 | - | 50 | - |
试剂一 | 150 | 150 | 150 |
混匀,25℃静置10min。测定640nm处吸光值A,分别记为A测定、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A空白,ΔA标准=A标准-A空白。(注:空白管只需测定1-2次。) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的D和W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。
2、按照样品质量算:
总黄烷醇含量(mg/g 质量 )= x×V1÷(W×V1÷V)×D= x÷W×D
3、按照液体体积算:
总黄烷醇含量(mg/mL)=x×D
V1:样品上样量,0.05mL; V:提取液体积,1mL;
D:稀释倍数,未稀释即为1; W:样品质量,g。
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