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一、产品简介:
β-葡聚糖化学名称为:(1-3) (1-4)-β-D-葡聚糖,是一类非淀粉多糖;研究发现,β-葡聚糖具有抗癌、降血脂、降血糖等功效。 本试剂盒利用葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶对样品中的(1-3) (1-4)-β-D-葡聚糖的酶解作用,由地衣聚糖酶转一性地水解β-葡聚糖成寡糖,β-葡萄糖苷酶则将寡糖水解成葡萄糖;葡萄糖被特异性氧化以产生与显色剂反应的(粉)红色产物,该产物在510nm有最大吸收峰,进而计算得出β-葡聚糖含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体45mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体100μL×1瓶 | -20℃保存 | 临用前加入 1.9mL 试剂一,充分溶解待用,用不完的试剂分装-20℃保存,避免反复冻融。 |
试剂三 | 液体50mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体500μL×1瓶 | -20℃保存 | 临用前加入 4.5mL 试剂五,充分溶解待用,用不完的试剂分装后-20℃保存,避免反复冻融。 |
试剂五 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂六 | 液体10mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
试剂七 | 液体10mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1mL试剂五,充分溶解后,-20℃保存。(即10mg/mL标准品母液) |
工作液的配制:临用前将试剂六和试剂七按 1:1 的比例混合,用多少配多少。 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵、天平、可调式移液器、涡旋振荡器、40目筛、无水乙醇、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备:
① 样本烘干粉碎,过40目筛。称取约0.05g烘干样本,加入1mL 80%乙醇,充分震荡混匀,80℃水浴10min后,取出冷却至室温。3000g,25℃离心10min,弃上清留沉淀,沉淀中再加入1mL 80%乙醇重复操作一次,离心后去上清留沉淀。
② 上步沉淀中加入0.8mL 试剂一,充分震荡混匀,95℃沸水浴5min,取出冷却至室温,加入40μL试剂二,剧烈振荡数秒,置于50℃恒温水浴锅中反应60min。
③ 取出冷却至室温,加入1mL 试剂三,充分混匀。5000g,25℃离心10min,取上清待测。
2、标准溶液的配制:把10mg/mL标准品母液用试剂五稀释成2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
S1 | 10 | 800 | 200 | 2 |
S2 | 2 | 500 | 500 | 1 |
S3 | 1 | 500 | 500 | 0.5 |
S4 | 0.5 | 500 | 500 | 0.25 |
S5 | 0.25 | 500 | 500 | 0.125 |
S6 | 0.125 | 500 | 500 | 0.0625 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至510nm。
② 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
上清液 | 100 | 100 | - | - |
标准品 | - | - | - | - |
试剂四 | 100 | - | - | - |
试剂五 | - | 100 | - | - |
混匀,50℃孵育10min,3000g离心5min,取上清备用。 | ||||
上清液 | 20 | 20 | - | - |
标准溶液 | - | - | 20 | - |
试剂五 | - | - | - | 20 |
工作液 | 180 | 180 | 180 | 180 |
混匀,50℃孵育20min,测定510nm处吸光值A,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A对照,ΔA标准=A标准-A空白。(注:每个样本需做一个自身对照,空白管只需测定1-2次。) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的D和W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。
2.按照样本质量计算:
β -葡聚糖含量(mg/g质量)=x×V2÷(W×V1÷V)×0.9×D=16.56×x÷W×D
V1:反应体系中样本体积,0.02mL; V2:反应体系总体积,0.2mL;
V:提取液总体积,1.84mL; 0.9:葡萄糖转化为β-葡聚糖的脱水转换因子;
D:稀释倍数,未稀释即为1; W:样本质量,g。
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