一、产品简介：

谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px 或 GPX，EC.1.11.1.9）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GPX 能够催化还原型谷胱甘肽（GSH）生成氧化型谷胱甘肽（GSSG），使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物。

GPX 催化有机过氧化物试剂 （Cum-OOH） 氧化 GSH，产生 GSSG，GSH 能与 DTNB 生成在 412nm 处有特征吸收峰的化合物，412nm 下吸光度的下降即可反应 GPX 的活性。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、超声细胞破碎仪、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：建议称取 0.1 g 组织，加入 1 mL 提取液进行冰浴匀浆。12000 rpm，4℃离心 10 min，取上清置冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：先收集细菌/细胞到离心管内，离心后弃上清；取500万细菌或细胞加入1mL提取液，冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3 min）然后 12000 rpm，4℃，离心 10min，取上清置冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例提取。

③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。

2、标准溶液的配制：把2.5μmol/mL标准品母液用蒸馏水稀释成0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0 μmol/mL的标准溶液备用。

3、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm。

② 操作表：

3、正式实验：

① 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

② 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。

五、结果计算：

1、以各个标准溶液的浓度为 x 轴，其对应的 A 标准吸光值为 y 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b，将 ΔA测定带入方程得到 x（μmol/mL）。

2、GPX活性计算：

（1）按蛋白浓度计算

活力单位定义：每 mg 蛋白在反应体系中每分钟催化 1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位（U）。

GPX (U/mg prot) =x×1000×V2÷（Cpr×V 1）÷T×D=2500×x÷Cpr×D

（2）按样本质量计算

活力单位定义：每 g 样本在反应体系中每分钟催化 1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位（U）。

GPX (U/g 质量)= x×1000×V2÷(V 1÷V×W)÷T×D=2500×x÷W×D

（3）按细胞数量计算

活力单位定义：每 10⁴ 个细胞在反应体系中每分钟催化 1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位（U）。

GPX (U/10⁴ cell)=x×1000×V2÷(V 1÷V×N)÷T×D=2500×x÷N×D

（4）按液体体积计算

活力单位定义：每 mL 液体在反应体系中每分钟催化 1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位（U）。

GPX (U/mL)= x×1000×V2÷V 1÷T×D=2500×x×D

V 2：酶促反应体系体积，1 mL；           V 1：加入样本体积，0.08 mL；             

V ：提取液体积，1 mL；                  T：反应时间，5 min；

Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；            N：细胞数量，以万计；                       

W：样本质量，g；                       1000：换算系数，1 μmol=1000 nmol。