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一、产品简介:
谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px 或 GPX,EC.1.11.1.9)是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解酶。GPX 能够催化还原型谷胱甘肽(GSH)生成氧化型谷胱甘肽(GSSG),使有毒的过氧化氢还原成无毒的羟基化合物。
GPX 催化有机过氧化物试剂 (Cum-OOH) 氧化 GSH,产生 GSSG,GSH 能与 DTNB 生成在 412nm 处有特征吸收峰的化合物,412nm 下吸光度的下降即可反应 GPX 的活性。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体8mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体4mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体80mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 液体2mL×1瓶 | 4℃保存 | 临用前25℃水浴5min |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1.6ml蒸馏水,充分溶解(即2.5μmol/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、超声细胞破碎仪、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:建议称取 0.1 g 组织,加入 1 mL 提取液进行冰浴匀浆。12000 rpm,4℃离心 10 min,取上清置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌/细胞到离心管内,离心后弃上清;取500万细菌或细胞加入1mL提取液,冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3s,间隔 7s,总时间 3 min)然后 12000 rpm,4℃,离心 10min,取上清置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、标准溶液的配制:把2.5μmol/mL标准品母液用蒸馏水稀释成0.25、0.2、0.15、0.1、0.05、0 μmol/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(μmol/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (μmol/mL) |
S1 | 2.5 | 160 | 40 | 0.25 |
S2 | 2.5 | 100 | 100 | 0.2 |
S3 | 2.5 | 100 | 100 | 0.15 |
S4 | 0.2 | 100 | 100 | 0.1 |
S5 | 0.1 | 0.1 | 100 | 0.05 |
S6 | - | 100 | - | 0 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至412nm。
② 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 空白管 | 标准管 |
试剂一 | 80 | 80 | - |
样本 | 80 | - | - |
蒸馏水 | - | 80 | - |
试剂二 | 40 | 40 | - |
25℃条件下反应5min | - | ||
试剂三 | 800 | 800 | - |
若有沉淀,需要12000rpm室温离心10min,上清液待测。 | - | ||
上步的上清 | 80 | 80 | - |
标准溶液 | - | - | 80 |
试剂四 | 100 | 100 | 100 |
试剂五 | 20 | 20 | 20 |
混匀,静置2min后,于412nm波长读取吸光度值A,分别记为A测定、A空白、A标准。计算ΔA测定=A空白-A测定。(注:空白管只需要测定1-2次。) |
3、正式实验:
① 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
② 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为 x 轴,其对应的 A 标准吸光值为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y=kx+b,将 ΔA测定带入方程得到 x(μmol/mL)。
2、GPX活性计算:
(1)按蛋白浓度计算
活力单位定义:每 mg 蛋白在反应体系中每分钟催化 1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。
GPX (U/mg prot) =x×1000×V2÷(Cpr×V 1)÷T×D=2500×x÷Cpr×D
(2)按样本质量计算
活力单位定义:每 g 样本在反应体系中每分钟催化 1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。
GPX (U/g 质量)= x×1000×V2÷(V 1÷V×W)÷T×D=2500×x÷W×D
(3)按细胞数量计算
活力单位定义:每 104 个细胞在反应体系中每分钟催化 1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。
GPX (U/104 cell)=x×1000×V2÷(V 1÷V×N)÷T×D=2500×x÷N×D
(4)按液体体积计算
活力单位定义:每 mL 液体在反应体系中每分钟催化 1 nmol GSH 氧化定义为一个酶活力单位(U)。
GPX (U/mL)= x×1000×V2÷V 1÷T×D=2500×x×D
V 2:酶促反应体系体积,1 mL; V 1:加入样本体积,0.08 mL;
V :提取液体积,1 mL; T:反应时间,5 min;
Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL; N:细胞数量,以万计;
W:样本质量,g; 1000:换算系数,1 μmol=1000 nmol。
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