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一、产品简介:
木糖是一种戊糖。天然D-木糖是以多糖的形态存在于植物中。木糖可以活化人体肠道内的双岐杆菌并促其生长,双歧杆菌是益菌,该菌越多越有益人体健康,食用木糖能改善人体的微生物环境,提高机体的免疫能力;同时木糖在小肠上段吸收后不参与体内的代谢,经肾脏排出。因此,D-木糖的吸收一直作为小肠吸收不良的重要功能指标。 D-木糖在强酸条件下水解产生糠醛,糠醛可与间苯三酚反应生成粉红色化合物,在554 nm处有特殊吸收峰,据此可由吸光值计算出样本中木糖的含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉体×3瓶 | 4℃避光保存 | 临用前每瓶加入10mL冰乙酸,混匀溶解后,再慢慢加入0.6mL浓盐酸混匀;用不完的试剂4℃保存一周。 |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1mL蒸馏水,充分溶解后,-20℃保存。(即10mg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、浓盐酸、冰乙酸、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取约0.1g样品,加入 1 mL 提取液,研磨匀浆后,在 100℃水浴锅中准确水解 2 h,然后于 10000 rpm,室温离心 15 min,弃沉淀,取上清液待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 血清(浆)等液体样本:直接测定,若浑浊则离心后测定。
2、标准溶液的配制:把10mg/mL标准品母液用蒸馏水稀释成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
S1 | 10 | 920 | 80 | 0.8 |
S2 | 0.8 | 500 | 500 | 0.4 |
S3 | 0.4 | 500 | 500 | 0.2 |
S4 | 0.2 | 500 | 500 | 0.1 |
S5 | 0.1 | 500 | 500 | 0.05 |
S6 | 0.05 | 500 | 500 | 0.025 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min,调节波长至554nm。
② 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 50 | - | - |
标准溶液 | - | 50 | - |
蒸馏水 | - | - | 50 |
试剂一 | 250 | 250 | 250 |
混匀,准确沸水浴(100℃)8min(防止水份散失,可用封口膜缠紧),冰浴冷却至室温,取200μL反应液至96孔板中,测定554nm处吸光值A,分别记为A测定、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A空白,∆A标准=A标准-A空白。(注:空白管只需测定1-2次)。 |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的D和W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。
2、按样本质量计算:
D-木糖含量(mg/g 质量)= x×V1÷(W×V1÷V)×D=x÷W×D
3、按液体体积计算:
D-木糖含量(mg/L)= x×V1÷V1×D=x×D
V1:加入样本体积,0.05mL; V:提取液体积,1mL;
W:样品质量,g; D:稀释倍数,未稀释即为1。
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