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一、产品简介:
多种微生物、动物、植物等都可产生几丁质酶,高等植物本身不存在作为真菌细胞壁组分之一的几丁质,但当植物受到病原菌感染时,几丁质酶活性迅速提高。因此该酶与植物对病原微生物的抗性有关,是重要的病程相关蛋白。
几丁质酶主要水解几丁质多聚体中的β-1,4-糖苷键,依据水解口位置的不同可分为内切几丁质酶和外切几丁质酶。几丁质酶催化几丁质水解形成的产物为N-乙酰葡萄糖胺(Glc-NAcc)单体,产物在580 nm处具有特征吸收峰,通过吸光值变化即可表征几丁质酶的活性。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体50mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体2mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体8mL×1瓶 | 4℃保存 | 使用前震荡摇匀 |
试剂三 | 液体4.5mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
试剂四 | 液体22mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 加入1mL蒸馏水,充分溶解 (即10mmol/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、超声波破碎仪、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、超声清洗仪、可调式移液器、冰、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆。10000g,4℃离心 20min,取上清,置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌或细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约500万细菌或细胞,加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);10000g,4℃离心 20min,取上清,置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、标准溶液的配制:把10mmol/mL标准品母液用蒸馏水稀释成0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 mmol/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mmol/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mmol/mL) |
S1 | 10 | 920 | 80 | 0.8 |
S2 | 0.8 | 500 | 500 | 0.4 |
S3 | 0.4 | 500 | 500 | 0.2 |
S4 | 0.2 | 500 | 500 | 0.1 |
S5 | 0.1 | 500 | 500 | 0.05 |
S6 | 0.05 | 500 | 500 | 0.025 |
S7 | 0.025 | 500 | 500 | 0.0125 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min,调节波长至580nm。
② 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
试剂一 | 20 | 20 | - | - |
试剂二 | 80 | 80 | - | - |
样本 | 100 | - | - | - |
37℃准确反应 3 h | - | - | ||
样本 | - | 100 | - | - |
沸水浴5min,10000rpm离心5min,取上清。 | - | - | ||
上清 | 100 | 100 | - | - |
标准溶液 | - | - | 100 | - |
蒸馏水 | - | - | - | 100 |
试剂三 | 40 | 40 | 40 | 40 |
沸水浴处理 5 min,迅速冷却至室温。 | ||||
试剂四 | 200 | 200 | 200 | 200 |
充分混匀,37℃反应 20 min。吸取 200μL 反应液至 96 孔板中,测定 580 nm 处吸光值,记为 A 测定、A 对照、A 标准和 A 空白。计算∆A 测定=A 测定-A 对照,∆A 标准=A 标准-A 空白。(注:空白管只需测定 1-2 次,每个样品均需设一个对照管。) |
3、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后或适当缩短 37℃水浴时间后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的T、D和W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、标准曲线的绘制:以ΔA标准为y轴,标准溶液浓度为x轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b。将ΔA测定带入标准方程中,得到x(mmol/mL)。
2、按照样本质量计算:
酶活性定义:37℃下,每g组织每小时分解几丁质产生1mmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位(U)。
几丁质酶活性(U/g 质量)=x×V2÷(V1÷V×W)÷T×D=0.67×x÷W×D
3、按照蛋白质浓度计算:
酶活性定义:37℃下,每mg蛋白每小时分解几丁质产生1mmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位(U)。
几丁质酶活性(U/mg prot)=x×V2÷(V1×Cpr)÷T ×D=0.67×x÷Cpr×D
4、按照细胞数量计算:
酶活性定义:37℃下,每104个细胞每小时分解几丁质产生1mmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位(U)。
几丁质酶活性(U/104cell)=x×V2÷(V1÷V×细胞数量)÷T×D =0.67×x÷细胞数量×D
5、按照样本体积计算:
酶活性定义:37℃下,每mL培养液每小时分解几丁质产生1mmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活性单位(U)。
几丁质酶活性(U/mL)=x×V2÷V1÷T×D =0.67×x×D
V1:反应体系中样本体积,0.1mL; V2:酶促反应总体积,0.2ml;
V:加入提取液体积,1mL; W:样本质量,g;
T:反应时间,3h; 细胞数量:以万计。
D:稀释倍数,未稀释即为1; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL。
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