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一、产品简介:
β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,β-1,3-GA,EC 3.2.1.39)主要存在植物中,催化β-1,3-葡萄糖苷键水解,进而破坏真菌细胞壁,特别是与几丁质酶的协同作用下,可明显抑制真菌的生长。在植物染病或处于其他逆境条件下,可诱导细胞大量合成β-1,3-GA,以增强植物体对不良外界刺激产生抗性反应,因此β-1,3-GA活性测定广泛应用于植物病理和逆境生理研究。 β-1,3-GA 水解昆布多糖,内切 β-1,3-葡萄糖苷键,产生还原末端,通过测定还原糖生成速率,来计算其酶活性。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体110mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体2mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体22mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1mL蒸馏水,充分溶解后,-20℃保存(即10mg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、超声清洗仪、可调式移液器、冰、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取约0.1g组织,加入1mL提取液,冰浴匀浆,12000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌或细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约500万细菌或细胞,加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测。若浑浊,离心后取上清检测。
2、标准溶液的配制:把10mg/mL标准品母液用蒸馏水稀释成1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
S1 | 10 | 440 | 60 | 1.2 |
S2 | 10 | 900 | 100 | 1.0 |
S3 | 1.0 | 100 | 400 | 0.8 |
S4 | 1.0 | 200 | 300 | 0.6 |
S5 | 0.8 | 200 | 200 | 0.4 |
S6 | 0.4 | 200 | 200 | 0.2 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min,调节波长至540nm。
② 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 30 | 30 | - | - |
标准溶液 | - | - | 30 | - |
蒸馏水 | - | 30 | 30 | 60 |
试剂一 | 30 | - | - | - |
充分混匀,40℃准确反应 10 min; | ||||
试剂二 | 190 | 190 | 190 | 190 |
充分混匀,沸水浴处理 5 min,冷却至室温。吸取 200 μL 反应液至 96 孔板中,测定 540 nm 处吸光值,记为A 测定、A 对照、A 标准和 A 空白。计算 ΔA 测定=A 测定-A 对照,ΔA 标准=A 标准-A 空白。(注:空白管只需测定 1-2 次,每个样品均需设定一个对照管。) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的D和W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。
2、按蛋白浓度计算:
酶活定义:每 mg 组织蛋白每小时生成 1 mg 还原糖定义为一个酶活力单位(U)。
β-1,3-GA(U/mg prot)=(x×V1)÷(V1×Cpr) ÷T×D=6×x÷Cpr×D
3、按样本质量计算:
酶活定义:每 g 组织样本每小时生成 1 mg 还原糖定义为一个酶活力单位(U)。
β-1,3-GA(U/g 质量)=(x×V1)÷(W×V1÷V) ÷T×D=6×x÷W×D
4、按细菌/真菌密度计算:
酶活定义:每 104 个细胞或细菌每小时生成 1 mg 还原糖定义为一个酶活力单位(U)。
β-1,3-GA(U/104 cell)=(x×V1)÷(细胞数量×V1÷V) ÷T×D=6×x÷细胞数量×D
5、按液体体积计算:
酶活定义:每 mL 液体样本每小时生成 1 mg 还原糖定义为一个酶活力单位(U)。
β-1,3-GA(U/mL)=x÷T×D=6×x×D
V:加入提取液体积,1mL; V1:加入样本体积,0.03mL;
T:反应时间,10min=1/6h; W:样本质量,g;
细菌或细胞数量:以万计; Cpr:样本蛋白质浓,mg/mL。
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