||
一、产品简介:
蔗糖磷酸合成酶(EC 2.4.1.14)的发现、结构及分布在1955 年 首次在小麦胚芽中检测到,随研究材料范围扩大和深入,发现光合组织(主要是叶片)和非光合组织(果实、贮藏块根、块茎等)中都广泛存在着 SPS。蔗糖磷酸合成酶参与植物的生长发育,是植物体内催化蔗糖合成的关键酶之一。 蔗糖磷酸合成酶催化果糖-6-磷酸形成蔗糖磷酸,蔗糖磷酸与间苯二酚反应生成有色物质,在480nm下有特征吸收峰,酶活力大小与颜色的深浅成正比。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体50mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体1.25mL×2支 | -20℃保存 | |
试剂二 | 液体1.8mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体25mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体7mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1mL蒸馏水,充分溶解后,-20℃保存。(即10mg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、冰、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
组织样本:称取约0.1g组织,加入1mL提取液,进行冰浴匀浆。12000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
2、标准溶液的配制:把10mg/mL标准品母液用蒸馏水稀释成4、3、2、1、0.5、0.25 mg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/mL) |
S1 | 10 | 300 | 200 | 4 |
S2 | 10 | 140 | 60 | 3 |
S3 | 4 | 200 | 200 | 2 |
S4 | 2 | 200 | 200 | 1 |
S5 | 1 | 200 | 200 | 0.5 |
S6 | 0.5 | 200 | 200 | 0.25 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至480nm。
② 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 | |||
样本 | 10 | 10 | - | - | |||
标准溶液 | - | - | 10 | - | |||
蒸馏水 | - | 45 | 45 | 55 | |||
试剂一 | 45 | - | - | - | |||
混匀,25℃准确水浴 10min。 | |||||||
试剂二 | 15 | 15 | 15 | 15 | |||
试剂二需直接加到反应液里面,且务必混匀(可用枪头吸打),95℃水浴中煮沸10min(可用封口膜缠紧,防止水分散失),冷却至室温。 | |||||||
试剂三 | 210 | 210 | 210 | 210 | |||
试剂四 | 60 | 60 | 60 | 60 | |||
混匀,95℃水浴20min,冷却至室温,取200μL反应液至96孔板中,测定480nm处吸光值A,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A对照,ΔA标准=A标准-A空白。(注:每个测定管需设一个对照管,空白管只需测定1-2次) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用蒸馏水适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的D和W代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(mg/mL)。
2、按照蛋白浓度计算:
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位(U)。
SPS活性(U/mg prot)=x×V1×103÷(V1×Cpr) ÷T =100×x÷Cpr
3、按照样本质量计算:
单位定义:每g组织每分钟催化产生1μg 蔗糖定义为一个酶活力单位(U)。
SPS活性(U/g质量)=x×V1×103÷(W×V1÷V) ÷T=100×x÷W
V:加入提取液体积,1 mL; V1:加入样本体积,0.01 mL;
T:反应时间,10 min; W:样本质量,g;
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL。
Archiver|手机版|科学网 ( 京ICP备07017567号-12 )
GMT+8, 2024-7-16 17:00
Powered by ScienceNet.cn
Copyright © 2007- 中国科学报社