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一、产品简介:
大豆异黄酮是黄酮类化合物,是大豆生长中形成的一类次级代谢产物,是一种生物活性物质。由于是从植物中提取,与雌激素有相似结构,因此大豆异黄酮又称植物雌激素。大豆异黄酮的雌激素作用影响到激素分泌、代谢生物学活性、蛋白质合成、生长因子活性,是天然的癌症化学预防剂。
本实验采用95%乙醇进行提取,利用染料木素作为标品,进行紫外260nm进行检测吸光值,采用单波长法进行含量计算。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 自备 | 4℃保存 | 95%乙醇 (95 mL 无水乙醇和 5 mL 蒸馏水充分混匀) |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃避光保存 | 临用前加入1mL提取液,充分溶解。 (即2000mg/L标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板(UV板)、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、无水乙醇、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.1g样本,加入1.5mL提取液进行匀浆,于4℃浸提24 h,12000rpm,4℃离心10min,取上清待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000rpm 4℃离心10min,取上清待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、标准溶液的配制:把2000mg/L标准品母液用提取液稀释成20、15、10、5、2.5、1.25mg/L的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(mg/L) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (mg/L) |
Sx | 2000 | 900 | 100 | 200 |
S1 | 200 | 1800 | 200 | 20 |
S2 | 200 | 925 | 75 | 15 |
S3 | 20 | 1000 | 1000 | 10 |
S4 | 10 | 1000 | 1000 | 5 |
S5 | 5 | 1000 | 1000 | 2.5 |
S6 | 2.5 | 1000 | 1000 | 1.25 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至260nm。
② 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 200 | - | - |
标准溶液 | - | 200 | - |
提取液 | - | - | 200 |
测定260nm处的吸光值A,分别记为A测定、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A空白,∆A标准=A标准-A空白。 (注:空白管只需测定1-2次) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用提取液适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的W和D代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(mg/L)。
2、异黄酮含量(mg/g 质量)=x×V÷W×D=0.0015×x÷W×D
V:加入提取液体积,1.5mL=0.0015L; W:样品质量,g;
D:稀释倍数,未稀释即为1。
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GMT+8, 2024-7-4 11:30
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