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一、产品简介:
体系内各种抗氧化大分子、小分子和酶的总水平,反映了该体系内的总抗氧化能力(T-AOC)。T-AOC能更全面地评价体液、细胞和组织匀浆、食品和饮料的抗氧化剂含量,广泛应用于医学、食品科学等相关研究。
DPPH为稳定的自由基,其醇溶液呈紫色,在515nm处有强吸收。当有抗氧化剂存在时,DPPH 自由基被清除,会发生脱色反应。因此可通过检测吸光度的变化,并以标准品作为对照体系来量化抗氧化物质的抗氧化能力。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体40mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂×1支 | 4℃避光保存 | 临用前加入1.5mL试剂一,充分溶解 (-20℃可保存一个月,建议分装保存,避免反复冻融) |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1.4mL提取液,充分溶解。 (即20μmol/mL标准品母液) |
工作液的配制(现用现配):使用前根据使用量按照试剂一:试剂二=9:1 的体积比配制,充分混匀即为 DPPH 工作液,现用现配。 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取约0.1g新鲜组织或者称取约0.02g烘干样本(将新鲜样本置于60℃烘箱烘干至恒重,粉碎,过40目筛,得到烘干样本),加入1mL提取液(若鲜样需研磨均质),于60℃,200-300W条件下超声提取30min(间隔5min振荡混匀一次),若有损失需用提取液定容至1mL。12000rpm,25℃离心10min,取上清测定。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;取约500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000rpm,25℃离心10min,取上清测定。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、标准溶液的配制:把20μmol/mL标准品母液用提取液稀释成1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2μmol/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(μmol/mL) | 稀释液体积(μL) | 标准液体积(μL) | 稀释后浓度 (μmol/mL) |
Sx | 20 | 470 | 30 | 1.2 |
S1 | 20 | 475 | 25 | 1.0 |
S2 | 1.0 | 40 | 160 | 0.8 |
S3 | 1.2 | 100 | 100 | 0.6 |
S4 | 0.8 | 100 | 100 | 0.4 |
S5 | 0.4 | 100 | 100 | 0.2 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至515nm。
② 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 10 | 10 | - | - |
标准溶液 | - | - | 10 | - |
提取液 | - | 190 | - | 10 |
工作液 | 190 | - | 190 | 190 |
混匀后,室温,避光反应30min,测定515nm处的吸光值A,分别记为A测定、A对照、A标准、A空白。(注:空白管只需做1-2次。) |
4、正式实验:
① 不同样本清除DPPH自由基的能力可能相差很大,为保证实验结果的准确性,样本要根据预实验结果进行适当调整(如清除率大于80%,建议将提取的样本用试剂一进行稀释;如清除率小于20%,建议加大样本质量),并将改变后的W和D代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的清除率(%)为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将清除率带入方程得到x(μmol/mL)。
标准品DPPH自由基清除率(%)=[(A空白-A标准)÷A空白×100]%
2、样本DPPH自由基清除率(%)=[(1-(A测定-A对照)÷A空白)×100]%
3、定义:用从标准曲线上获得的抗氧化剂的量来表示样本的DPPH自由基清除能力。
4、按样本质量计算:
DPPH自由基清除能力(μmol/g 质量)=x×V1÷(V1÷V×W) ×D=x÷W×D
5、按细菌/细胞计算:
DPPH自由基清除能力(μmol/104 cell)=x×V1÷(V1÷V×N) ×D=x÷N×D
6、液体样本:
DPPH自由基清除能力(μmol/mL)=x×V1÷V1×D=x×D
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.01mL;
W:样本质量,g; N:细胞数量,以万计;
D:稀释倍数,未稀释即为1。
注意事项:
样本建议当天提取,当天检测。
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