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多酚氧化酶(PPO)活性检测试剂盒说明书 (货号:NM-W-0107 微量法100T/48S)

已有 235 次阅读 2024-5-23 10:07 |系统分类:科研笔记

一、产品简介:

多酚氧化酶(polyphenol oxidasePPO)又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶,是一类广泛分布于动物、植物、微生物和培养细胞中的含铜质体金属酶,能够催化多酚类物质氧化为醌,进而引起植物叶片、果实等发生褐变,其活性对于果蔬加工、保藏及茶叶初加工等过程具有重要作用。

多酚氧化酶能够催化邻苯二酚生成醌,产物在410nm处具有特征吸收峰,通过吸光值变化即可表征多酚氧化酶的活性。

二、试剂盒组分与配制:

试剂名称

规格

保存要求

备注

提取液

液体50mL×1

4保存

试剂一

液体20mL×1

4保存

试剂二

液体5mL×1

4避光保存

三、需自备的仪器和用品:

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰

四、操作步骤

建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!

1、预实验样本制备

组织样本:称取0.1g样本加入1mL提取液进行冰浴匀浆12000rpm4离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)15~10的比例进行提取。

 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000rpm4离心10min,取上清置冰上待测。注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~10001的比例进行提取。

液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清置冰上待测

2、预实验上机操作:

酶标仪预热30min以上,调节波长至410nm

 对照管样本的制备:取适量样本上清液95℃处理5min(密封以防止水分散失),冷却至室温。

操作表

试剂名称(μL

测定管

对照管

试剂一

200

200

试剂二

50

50

样本

50

-

煮沸的样本

-

50

①37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)准确反应10min

立即95℃处理10min(密封以防止水分散失);

冷却至室温后,10000rpm25离心10min,取上清;

吸取200μL上清液至96孔板中,测定410nm吸光值,记为A测定和A对照,计算ΔA=A测定-A对照。注:每个样品均需设一个对照管。

3、正式实验:

 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;

 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。

五、结果计算:

a.用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下:

1按组织蛋白浓度计算:

单位定义:每分钟每mg组织蛋白使反应体系吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位(U)

PPO活性U/mg prot=ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr

2、组织样本质量计算:

单位定义:每分钟每g组织使反应体系吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位(U)

PPO活性U/g质量=ΔA×V2÷(W×V1÷V)÷0.01÷T=60×ΔA÷W

3、按照液体体积计算:

单位定义:每分钟每mL液体使反应体系吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位(U)

PPO活性U/mL=ΔA×V2÷V1÷0.01÷T=60×ΔA

4、按细菌或细胞数量计算:

单位定义:每分钟每104细菌或细胞使反应体系吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位(U)

PPO活性U/104 cell=ΔA×V2÷(N×V1÷V)÷0.01÷T=60×ΔA÷N

 

V加入提取液体积,1mL;                  V1:反应中样本体积,0.05mL

V2:反应体系总体积,0.3mL                T:反应时间,10min

W样品质量,g                           N: 细胞数量,以万计;           

Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL

 

b.96 孔板测定的计算公式如下:

1、按组织蛋白浓度计算:

单位定义:每分钟每mg组织蛋白使反应体系吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位(U)

PPO活性U/mg prot=ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.005÷T =120×ΔA÷Cpr

3、组织样本质量计算:

单位定义:每分钟每g组织使反应体系吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位(U)

PPO活性U/g质量=ΔA×V2÷(W×V1÷V)÷0.005÷T=120×ΔA÷W

3、按照液体体积计算:

单位定义:每分钟每mL液体使反应体系吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位(U)

PPO活性U/mL=ΔA×V2÷V1÷0.005÷T=120×ΔA

4、按细菌或细胞数量计算:

单位定义:每分钟每104细菌或细胞使反应体系吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位(U)

PPO活性U/104 cell=ΔA×V2÷(N×V1÷V)÷0.005÷T=120×ΔA÷N

 

V加入提取液体积,1mL;                  V1:反应中样本体积,0.05mL

V2:反应体系总体积,0.3mL                T:反应时间,10min

W样品质量,g                           N: 细胞数量,以万计;

Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL



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