一、产品简介：

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）又称酪氨酸酶、儿茶酚酶、酚酶，是一类广泛分布于动物、植物、微生物和培养细胞中的含铜质体金属酶，能够催化多酚类物质氧化为醌，进而引起植物叶片、果实等发生褐变，其活性对于果蔬加工、保藏及茶叶初加工等过程具有重要作用。

多酚氧化酶能够催化邻苯二酚生成醌，产物在410nm处具有特征吸收峰，通过吸光值变化即可表征多酚氧化酶的活性。

二、试剂盒组分与配制：

三、需自备的仪器和用品：

酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。

四、操作步骤：

建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

1、预实验样本制备

① 组织样本：称取0.1g样本，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。

② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；建议500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴）：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取。

③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清置冰上待测。

2、预实验上机操作：

① 酶标仪预热30min以上，调节波长至410nm。

② 对照管样本的制备：取适量样本上清液95℃处理5min（密封以防止水分散失），冷却至室温。

③ 操作表：

3、正式实验：

① 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备；

② 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。

五、结果计算：

a.用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下:

1、按组织蛋白浓度计算：

单位定义：每分钟每mg组织蛋白使反应体系吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位(U)。

PPO活性（U/mg prot）=ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.01÷T =60×ΔA÷Cpr

2、按组织样本质量计算：

单位定义：每分钟每g组织使反应体系吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位(U)。

PPO活性（U/g质量）=ΔA×V2÷(W×V1÷V)÷0.01÷T=60×ΔA÷W

3、按照液体体积计算：

单位定义：每分钟每mL液体使反应体系吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位(U)。

PPO活性（U/mL）=ΔA×V2÷V1÷0.01÷T=60×ΔA

4、按细菌或细胞数量计算：

单位定义：每分钟每10⁴个细菌或细胞使反应体系吸光值变化0.01定义为一个酶活力单位(U)。

PPO活性（U/10⁴ cell）=ΔA×V2÷(N×V1÷V)÷0.01÷T=60×ΔA÷N

V：加入提取液体积，1mL；                  V1：反应中样本体积，0.05mL；

V2：反应体系总体积，0.3mL；                T：反应时间，10min；

W：样品质量，g；                           N: 细胞数量，以万计；           

Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下:

1、按组织蛋白浓度计算：

单位定义：每分钟每mg组织蛋白使反应体系吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位(U)。

PPO活性（U/mg prot）=ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.005÷T =120×ΔA÷Cpr

3、按组织样本质量计算：

单位定义：每分钟每g组织使反应体系吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位(U)。

PPO活性（U/g质量）=ΔA×V2÷(W×V1÷V)÷0.005÷T=120×ΔA÷W

3、按照液体体积计算：

单位定义：每分钟每mL液体使反应体系吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位(U)。

PPO活性（U/mL）=ΔA×V2÷V1÷0.005÷T=120×ΔA

4、按细菌或细胞数量计算：

单位定义：每分钟每10⁴个细菌或细胞使反应体系吸光值变化0.005定义为一个酶活力单位(U)。

PPO活性（U/10⁴ cell）=ΔA×V2÷(N×V1÷V)÷0.005÷T=120×ΔA÷N

V：加入提取液体积，1mL；                  V1：反应中样本体积，0.05mL；

V2：反应体系总体积，0.3mL；                T：反应时间，10min；

W：样品质量，g；                           N: 细胞数量，以万计；

Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。