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一、产品简介:
植物体内游离脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性,抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外,由于脯氨酸亲水性极强,能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程,因而能降低凝固点,有防止细胞脱水的作用。在低温条件下,植物组织中脯氨酸含量增加,可提高植物的抗寒性,因此,亦可作为抗寒育种的生理指标。
脯氨酸经磺基水杨酸(SSA)提取后,与酸性茚三酮反应生成红色物质,产物经甲苯萃取,测定520 nm 处吸光值变化即可定量检测脯氨酸的含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体120mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
试剂一 | 自备 | 4℃保存 | 冰乙酸 |
试剂二 | 液体30mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
试剂三 | 自备 | 4℃保存 | 甲苯 |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 临用前加入1mL蒸馏水,充分溶解。(即10mg/mL标准品母液) |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、冰乙酸、甲苯、蒸馏水。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.1g样本,加入1mL提取液进行匀浆,于沸水浴震荡提取10min,冷却至室温,12000rpm,25℃离心10min,取上清待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);之后置于沸水浴振荡提取10min,冷却至室温,12000rpm,25℃离心10min,取上清待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 血清(浆)样本:取0.1mL血清(浆)加入0.9mL提取液,充分混匀,之后置于沸水浴振荡提取10min,冷却至室温,12000rpm,25℃离心10min,取上清待测。【注】若增加样本量,可按照血清(浆)体积(mL):提取液体积(mL)为1:5~10的比例提取。
2、标准溶液的配制:把10mg/mL(即10000μg/mL)标准品母液用蒸馏水稀释成40、20、10、5、2.5、1.25μg/mL的标准溶液备用。
编号 | 稀释前浓度(μg/mL) | 稀释液体积 (μL) | 标准液体积 (μL) | 稀释后浓度 (μg/mL) |
Sx | 10000 | 900 | 100 | 1000 |
S1 | 1000 | 960 | 40 | 40 |
S2 | 40 | 500 | 500 | 20 |
S3 | 20 | 500 | 500 | 10 |
S4 | 10 | 500 | 500 | 5 |
S5 | 5 | 500 | 500 | 2.5 |
S6 | 2.5 | 500 | 500 | 1.25 |
3、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至520nm。
② 操作表:
试剂名称(µL) | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | 250 | - | - |
标准溶液 | - | 250 | - |
蒸馏水 | - | - | 250 |
试剂一 | 250 | 250 | 250 |
试剂二 | 250 | 250 | 250 |
试剂三 | 500 | 500 | 500 |
振荡混匀 30s,静置片刻(使色素完全转至上层甲苯中);取200μL上层溶液至96孔板中,测定520nm处的吸光值A,分别记为A测定、A标准、A空白。计算ΔA测定=A测定-A空白,∆A标准=A标准-A空白。(注:空白管只需测定1-2次。) |
4、正式实验:
① 若预实验测定吸光值超出标准吸光值线性范围:高于最高值建议将待测样本用提取液适当稀释后再进行测定,低于最低值建议适当增加样本质量W后再进行测定,并将改变后的W和D代入公式计算;
② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
③ 正式实验按照预实验操作步骤进行(标准管和空白管预实验已做,正式实验可选做)。
五、结果计算:
1、以各个标准溶液的浓度为x轴,其对应的ΔA标准为y轴,绘制标准曲线,得到标准方程y=kx+b,将ΔA测定带入方程得到x(μg/mL)。
2、按照组织蛋白浓度计算:
脯氨酸含量(μg/g质量)=x×V1÷(Cpr×V1)×D=x÷Cpr×D
3、按照样本质量计算:
脯氨酸含量(μg/g质量)=x×V1÷(W×V1÷V)×D=x÷W×D
4、按细菌或细胞数量计算:
脯氨酸含量(μg/104 cell)=x×V1÷(N×V1÷V)×D=x÷N×D
5、按照血清(浆)体积计算:
脯氨酸含量(μg/mL)=x×V1÷(V1×V2÷V)×D=10×x×D
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.25mL;
V2:加入血清(浆)的体积,0.1 mL; N:细胞数量,以万计;
W:样品质量,g; D:稀释倍数,未稀释即为1; Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。
注意事项:
提取液中含有蛋白沉淀剂,若采用蛋白浓度计算方式,需单独使用PBS提取后再测定蛋白浓度。
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