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一、产品简介:
丙二醛(malondialdehyde,MDA)是由于生物体官衰老或在逆境条件下受伤害,其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的。它的含量与生物体衰老及逆境伤害有密切关系。
MDA与硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)缩合,生成红色产物,在532nm有最大吸收峰,进行比色后可估测样品中过氧化脂质的含量;同时测定600nm下的吸光度,利用 532nm与600nm下的吸光度的差值计算MDA的含量。
二、试剂盒组分与配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃避光保存 | |
工作液 | 液体30mL×1瓶 | 4℃避光保存 | 使用前于60℃加热振荡,充分溶解。 |
三、需自备的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。
四、操作步骤:
建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费!
1、预实验样本制备
① 组织样本:称取0.1g样本,加入1mL提取液进行冰浴匀浆,12000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000rpm,4℃离心10min,取上清置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清检测。
2、预实验上机操作:
① 酶标仪预热30min以上,调节波长至532nm和600nm。
② 操作表:
试剂名称(μL) | 测定管 |
工作液 | 300 |
样本 | 200 |
混匀后,95℃水浴30min,取出放冰上冷却至室温,12000rpm离心10min,取200μL上清液至96孔板中,测定532nm和600nm处的吸光值A,记为A532、A600。计算ΔA= A532-A600。 |
3、正式实验:
① 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备;
② 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。
五、结果计算:
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
1、按组织样本质量计算:
MDA 含量(nmol/g 质量)=[ΔA÷(ε×d) ×V2×109]÷(W ×V1÷V)=16.13×ΔA÷W
2、按细胞数量计算:
MDA含量(nmol/104 cell)=[ΔA÷(ε×d) ×V2×109]÷(N×V1÷V)=16.13×ΔA÷N
3、按液体体积计算:
MDA含量(nmol/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1=16.13×ΔA
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.2mL;
V2:样本提取液与工作液总反应液体积,5×10-4 L; d:比色皿光径,1cm;
ε:MDA 摩尔消光系数,155×103 L/mol /cm N:细胞数量,以万计;
W:样品质量,g;
b.用 96 孔板测定的计算公式如下:
1、按组织样本质量计算:
MDA 含量(nmol/g 质量)=[ΔA÷(ε×d) ×V2×109]÷(W ×V1÷V)=32.26×ΔA÷W
4、按细胞数量计算:
MDA含量(nmol/104 cell)=[ΔA÷(ε×d) ×V2×109]÷(N×V1÷V)=32.26×ΔA÷N
5、按液体体积计算:
MDA含量(nmol/mL)=[ΔA×V2÷(ε×d)×109]÷V1=32.26×ΔA
V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.2mL;
V2:样本提取液与工作液总反应液体积,5×10-4 L; d:96孔板光径,0.5cm;
ε:MDA 摩尔消光系数,155×103 L/mol /cm N:细胞数量,以万计;
W:样品质量,g;
注意事项:
若是样本量极少的血清样本,可减少加样体积V1(如由200μL减至25μL,并用生理盐水或蒸馏水补齐200μL),则改变后的加样量V1需重新代入公式计算。
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