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过氧化物酶(POD)活性检测试剂盒说明书 (货号:NM-W-0103 微量法100T/96S)

已有 195 次阅读 2024-5-17 08:55 |系统分类:科研笔记

一、产品简介: 过氧化物酶(Peroxidase,POD)广泛分布于生物界,在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用,如清除细胞内的有害物质H2O2、保护酶蛋白及促进植物细胞木质素的形成等。因此,POD酶活性是衡量植物在胁迫情况下的一个非常重要的生理指标。 POD催化H2O2氧化特定底物生成红棕色产物,该产物在470nm有特征光吸收。 二、试剂盒组分与配制: 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体120mL×1瓶 4℃保存 试剂一 液体20mL×1瓶 4℃保存 试剂二 液体1mL×1支 4℃避光保存 试剂三 液体1mL×1支 4℃避光保存 三、需自备的仪器和用品: 酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。 四、操作步骤: 建议正式实验前选取2个样本做预测定,了解本批样品情况,熟悉实验流程,避免实验样本和试剂浪费! 1、预实验样本制备 ① 组织样本:称取0.1g样本,加入1mL提取液进行冰浴匀浆,12000rpm,4℃离心10min,取上清置于冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;建议500万细菌或细胞加入1mL提取液,超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率200W,超声3s,间隔10s,重复30次);12000rpm,4℃离心10min,取上清置冰上待测。【注】:若增加样本量,可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1的比例进行提取。 ③ 液体样本:直接检测;若浑浊,离心后取上清置冰上待测。 2、预实验上机操作: ① 酶标仪预热30min以上,调节波长至470nm。 ② 测定前将试剂一、二和三解冻至37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)。 ③ 操作表: 试剂名称(μL) 测定管 样本 5 试剂一 175 试剂二 10 试剂三 10 在96孔板中按顺序加入上述试剂,迅速混匀并计时,记录470nm下30s时的吸光值A1和1min30s时吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。 3、正式实验: ① 若ΔA小于0.005,可将反应时间延长到5min,计算时除以改变后的反应时间即可;若ΔA大于0.9或者反应液中有较多气泡产生,可将样本用提取液进行稀释,计算时乘以相应的稀释倍数即可; ② 确定好最适实验条件后,正式实验样本制备同预实验样本制备; ③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。 五、结果计算: a、用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下: 1、按组织蛋白浓度计算: 活性单位定义:每mg组织蛋白每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.01为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/mg prot) =ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.01÷T=4000×ΔA÷Cpr 2、按组织样本质量计算: 活性单位定义:每g组织每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.01为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/g 质量)=ΔA×V2÷(W×V1÷V)÷0.01÷T =4000×ΔA÷W 3、按细胞数量计算: 活性单位定义:每104个细胞每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.01为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/104cell)=ΔA×V2÷(N×V1÷V)÷0.01÷T=4000×ΔA÷N 4、按血清(浆)体积计算: 活性单位定义:每mL血清(浆)每分钟在每 mL反应体系中使470nm处吸光值变化0.01为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/mL)=ΔA×V2÷V1÷0.01÷T =4000×ΔA V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.005mL; V2:反应体系总体积,0.2mL; T:反应时间,1min; W:样品质量,g; N:细胞数量,以万计; Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。 b、用 96 孔板测定的计算公式如下: 1、按组织蛋白浓度计算: 活性单位定义:每mg组织蛋白每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.005为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/mg prot) =ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.005÷T=8000×ΔA÷Cpr 5、按组织样本质量计算: 活性单位定义:每g组织每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.005为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/g 质量)=ΔA×V2÷(W×V1÷V)÷0.005÷T =8000×ΔA÷W 6、按细胞数量计算: 活性单位定义:每104个细胞每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.005为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/104cell)=ΔA×V2÷(N×V1÷V)÷0.005÷T=8000×ΔA÷N 7、按血清(浆)体积计算: 活性单位定义:每mL血清(浆)每分钟在每 mL反应体系中使470nm处吸光值变化0.005为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/mL)=ΔA×V2÷V1÷0.005÷T =8000×ΔA V:加入提取液体积,1mL; V1:反应中样本体积,0.005mL; V2:反应体系总体积,0.2mL; T:反应时间,1min; W:样品质量,g; N:细胞数量,以万计; Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL。 注意事项: 如一次测定的样本数量较多,试剂一、试剂二、试剂三按照比例混合成工作液,在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)放置10min,测定时加入195μL工作液即可。

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