一、产品简介： 过氧化物酶（Peroxidase，POD）广泛分布于生物界，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用，如清除细胞内的有害物质H2O2、保护酶蛋白及促进植物细胞木质素的形成等。因此，POD酶活性是衡量植物在胁迫情况下的一个非常重要的生理指标。 POD催化H2O2氧化特定底物生成红棕色产物，该产物在470nm有特征光吸收。 二、试剂盒组分与配制： 试剂名称 规格 保存要求 备注 提取液 液体120mL×1瓶 4℃保存 试剂一 液体20mL×1瓶 4℃保存 试剂二 液体1mL×1支 4℃避光保存 试剂三 液体1mL×1支 4℃避光保存 三、需自备的仪器和用品： 酶标仪、96孔板、台式离心机、恒温水浴锅/培养箱、研钵/匀浆器、天平、可调式移液器、蒸馏水和冰。 四、操作步骤： 建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！ 1、预实验样本制备 ① 组织样本：称取0.1g样本，加入1mL提取液进行冰浴匀浆，12000rpm，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。 ② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；建议500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm，4℃离心10min，取上清置冰上待测。【注】：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为500~1000：1的比例进行提取。 ③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清置冰上待测。 2、预实验上机操作： ① 酶标仪预热30min以上，调节波长至470nm。 ② 测定前将试剂一、二和三解冻至37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）。 ③ 操作表： 试剂名称（μL） 测定管 样本 5 试剂一 175 试剂二 10 试剂三 10 在96孔板中按顺序加入上述试剂，迅速混匀并计时，记录470nm下30s时的吸光值A1和1min30s时吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。 3、正式实验： ① 若ΔA小于0.005，可将反应时间延长到5min，计算时除以改变后的反应时间即可；若ΔA大于0.9或者反应液中有较多气泡产生，可将样本用提取液进行稀释，计算时乘以相应的稀释倍数即可； ② 确定好最适实验条件后，正式实验样本制备同预实验样本制备； ③ 正式实验按照预实验上机操作步骤进行。 五、结果计算： a、用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下： 1、按组织蛋白浓度计算： 活性单位定义：每mg组织蛋白每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.01为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/mg prot) =ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.01÷T=4000×ΔA÷Cpr 2、按组织样本质量计算： 活性单位定义：每g组织每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.01为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/g 质量)=ΔA×V2÷(W×V1÷V)÷0.01÷T =4000×ΔA÷W 3、按细胞数量计算： 活性单位定义：每104个细胞每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.01为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/104cell)=ΔA×V2÷(N×V1÷V)÷0.01÷T=4000×ΔA÷N 4、按血清（浆）体积计算： 活性单位定义：每mL血清(浆)每分钟在每 mL反应体系中使470nm处吸光值变化0.01为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/mL)=ΔA×V2÷V1÷0.01÷T =4000×ΔA V：加入提取液体积，1mL； V1：反应中样本体积，0.005mL； V2：反应体系总体积，0.2mL； T：反应时间，1min； W：样品质量，g； N：细胞数量，以万计； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。 b、用 96 孔板测定的计算公式如下： 1、按组织蛋白浓度计算： 活性单位定义：每mg组织蛋白每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.005为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/mg prot) =ΔA×V2÷(V1×Cpr)÷0.005÷T=8000×ΔA÷Cpr 5、按组织样本质量计算： 活性单位定义：每g组织每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.005为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/g 质量)=ΔA×V2÷(W×V1÷V)÷0.005÷T =8000×ΔA÷W 6、按细胞数量计算： 活性单位定义：每104个细胞每分钟在反应体系中使470nm处吸光值变化0.005为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/104cell)=ΔA×V2÷(N×V1÷V)÷0.005÷T=8000×ΔA÷N 7、按血清（浆）体积计算： 活性单位定义：每mL血清(浆)每分钟在每 mL反应体系中使470nm处吸光值变化0.005为一个酶活单位(U)。 POD活性(U/mL)=ΔA×V2÷V1÷0.005÷T =8000×ΔA V：加入提取液体积，1mL； V1：反应中样本体积，0.005mL； V2：反应体系总体积，0.2mL； T：反应时间，1min； W：样品质量，g； N：细胞数量，以万计； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL。 注意事项： 如一次测定的样本数量较多，试剂一、试剂二、试剂三按照比例混合成工作液，在37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）放置10min，测定时加入195μL工作液即可。

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