基于酵母转录因子GAL4的酵母双杂交筛选技术

趁着现在还没有忘记，回顾一下个人研究生期间主要的方向内容之一：酵母双杂交实验。最终顺利毕业，拿了一次国奖，评上那一届的“优秀研究生毕业生”。其基本原理比较简单如图，但实验并不是很easy。在这里分享一下个人的一些心得和注意事项：本实验是按Clontech公司试剂盒做的，主要参照参照其说明书。

1.  文库构建。这个决定后期实验的成败，文库构建好了（实验就成功了1/3）才可能筛选到你想要的互作蛋白。

反转录：首先RNA一定要提取好，RNA量一定足。反转录没什么说的，LD-PCR扩增第二链的时候一定要按RNA的量来选择扩增数，不可随意增加cycle数，否则 cDNA电泳看起来很好很亮，实际上很多非特异扩增，后期筛选出来的很多都是各种小的或多次重复片段（想想当初都是泪）。

纯化：用CHROMA SPIN TE-400 column进行cDNA纯化注意，要加入到柱子填充物中间（注意不要加到壁上），而且要水平离心机离心，否则cDNA直接从内壁边缘流下，根本起不到纯化效果。纯化最后一步，沉淀DNA去上清时，一定要慢慢倒，否则cDNA直接被倒掉，最后什么也没有。建议依次用大、中、小枪贴着离心管壁吸取上清，

文库制备：转化Y187菌株后涂板，尽量按要求涂100个150mm的大板，不行的话，也得涂个80个。构建好了文库，需要进行滴度检测，还要随机挑取一些菌落进行AD通用引物扩增测序，看插入片段是否有多聚A尾，一般都有20多个A，这样才是符合实验流程的（接头是有多聚A的），否则合成或扩增有问题。

2. 诱饵蛋白。主要是进行毒性和自激活检测。自激活解决方案：删除和截短。

可以先从中间断开，看自激活实在N或C端，如自激活在N端，那么下一步可以从全长的N端逐步删除，直到没有自激活。反之从C端。

3.杂交筛选。按照步骤摇菌进行meating（要注意文库和诱饵的比例）；建议meating后直接涂四缺板（不加Aba和显色剂），不要涂二缺，否则满版长得都是根本没法挑。涂四缺后，基本一个板会长0~4个的样子，40~50个板也不少了。将这些长起来的菌挑取点到加了Aba和显色剂的四缺板。培养2天，AD通用引物扩增显蓝色的菌落，割胶（不用回收）测序。

4.后续比对。主要是NCBI，phytozome(植物的网站)，如果自己的物种已经完成基因组测序的，可以构建本地数据库直接比对。

5.共转化验证。将比对到的有可能的基因全长克隆到AD载体上，与BD诱饵共转化Y2H gold菌株。

6.其他验证工作：可以选择体外的pull-down,体内的双荧光互补等相关实验。

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