猴痘病毒（2）：检测技术与研究展望

一、猴痘病毒实验室诊断和检测技术

人感染猴痘的症状包括流感样前驱症状（发热、乏力、寒战和肌痛等）和淋巴结肿大等，随后出现部分或全身性脓疱疹，临床上猴痘无法与其他正痘病毒感染区分开。此外，水痘 -带状疱疹病毒（VZV）、单纯疱疹病毒(HSV)、麻疹病毒、登革热病毒、口蹄疫病毒（HFMD）等其它可引起发热出疹性感染，对猴痘的临床诊断也会造成干扰。病例诊断，一般需要综合临床症状、流行病学信息和实验室检测结果。通过对这三方面的信息进行研判分析，可以将临床猴痘病例分为疑似、可能、确诊和排除4类。对于有临床表现的可疑病例，需要获取症状出现前21天内的流行病学信息，包括是否有猴痘病例报告国家或地区的旅居史，是否与猴痘确证或疑似病例有密切接触，是否接触过病例报告国家或地区（特别是非洲地方性流行地区）的野生动物及其动物产品或外来宠物等。

临床诊断中，实验室检测结果具有确证意义。猴痘的实验室检测方法包括核酸检测、基因测序、抗体抗原检测、病毒分离和电镜观察^]等。这些方法是建立在不同的生物学原理上，针对猴痘病毒的不同靶标，在特异性、敏感性和应用场景等方面表现不一，构成了各具特色的检测体系。表1列举了猴痘常见检测方法的特点及应用场景。

不同的实验室由于不同的科学目的，对检测方法的要求也不尽相同。对于临床和公共卫生实验室而言，首先考虑的是建立一种或几种快速、敏感和特异的检测方法，这对临床救治和公共卫生预防干预措施的制定都具有重要意义。正痘病毒各成员具有较高的同源性，因此传统的抗原抗体检测方法一般只能鉴定到正痘病毒属层面，而且敏感性也较低。30多年来，靶向核酸的分子生物学检测技术发展迅速，出现了诸如PCR技术、数字PCR技术以及诸多等温扩增技术（包括“Loop-mediated isothermal amplification，LAMP、recombinase-aid amplification，RAA；polymerase amplification，RPA等）。基于PCR的检测技术（特别是real-time PCR技术），给分子诊断领域带来了一种范式转换，近年来在病原微生物检测领域得到了广泛应用。针对2022年猴痘在北美地区的传播，美国CDC公布了一套基于real-time PCR技术的实验室检测程序。这套real-time PCR技术在正痘病毒属（不包括天花病毒）、猴痘病毒以及猴痘病毒I与II分支三个层面展开特异性检测，临床上既可以鉴别到I和II分支，也可以最大程度的避免由于流行毒株基因突变造成实验结果假阴性的出现。 需要注意的是，实验过程也要对引起出诊的一些其他病毒（如HSV、VZV、ENV和HFMD等）进行核酸鉴别诊断；如果是儿童病例，还要考虑肠道病毒感染的可能。此外，实验过程需要做好必要的生物安全防护，实验操作最好在BSL-3级实验室内完成。如果没有BSL-3级实验室，也可以在BSL-2级实验室里开展，但要求按照BSL-3级实验室的防护和操作规程进行，而且操作人员最好接种过疫苗。

序列测定是病毒分子诊断的金标准，也是其它分子诊断方法开发和持续改进的基础。此外，序列测定也是了解病毒分子进化和对病毒进行分子溯源的前提。近年来高通量测序技术发展迅猛，这是与传统Sanger测序法相区别一系列测序新技术，又称之为次代测序技术（next generation sequencing，NGS）。一些有条件的国家和地区，可以根据情况在临床或公共卫生实验室建立测序平台，作为实验室检测和病毒分子特性分析的强大工具。在猴痘疫情处置中，一般需要对病例的感染进行流行病学溯源。病例毒株高通量测序分析，为病毒溯源提供了精准的实验室手段。自2017年尼日利亚爆发以来，特别是2022年疫情，IIb-B1谱系病毒的生物学特性为何出现如此明显的改变，通过高通量测序分析已经在基因组和分子进化层面上获得部分解释，这也显示了测序技术对于猴痘病毒研究的重要性。

与分子生物学检测技术相比，一些传统的实验室检测技术仍有不可替代的作用。传统上，病毒分离培养一直是病原学诊断的金标准。病毒培养需要较长时间，而且生物安全要求较高，因此，一般临床实验室不建议进行猴痘病毒培养。猴痘病毒分离培养需要在BSL-3级实验室里开展，操作者也要做好个人防护。病毒分离工作对于进一步开展病毒基础研究(如基因功能和致病机理研究等)和疫苗与药物研发等提供了不可替代的生物资源。

正痘病毒有共同的起源，基因和蛋白的同源性较高，在抗原抗体诊断上存在明显的交叉反应。因此，猴痘病毒的抗原抗体检测一般只能鉴定到正痘病毒属层面上，不能实现猴痘的特异性诊断。猴痘感染一般在发病后的5天和8天内就可以产生IgM和IgG。临床上，疑似病例的IgM阳性或者恢复期与急性期IgG有4倍及以上升高，均提示新近暴露过正痘病毒(包括自然感染或接种疫苗)。猴痘抗体检测技术可以作为临床诊断的辅助手段，同时在血清流行病学和疫苗评价等工作中发挥重要作用。临床检测中，检测猴痘病毒抗原的免疫组织化学技术已经很少应用，但在病毒的致病机理研究中仍有重要价值。此外，用于抗原检测的层析免疫技术（LFI），有很好的正痘病毒属特异性，但敏感性比核酸检测低。LFI的优点是易于商品化，作为一种辅助诊断手段，适合在现场和基层环境应用。

二.研究展望

猴痘病毒从1958年被发现，到2022年引发全球疫情并成为“国际关注的突发公共卫生事件”，已经经历了60多年的进化。在这一过程中，病毒逐渐增强对人的适应力，从最初的动物跨种“外溢”感染，突变到有限的人际传播，再进化到2022年疫情持续的人际传播。关于猴痘病毒适应人体的机制，虽然有一些初步基因组分析结论，但仍需要从病毒、宿主及其相互作用等方面深入研究。

1980年全球消灭了天花，也随之停止天花疫苗接种。天花疫苗对猴痘病毒有85%的交叉保护力，因此1980年后出生的人群对包括猴痘病毒在内的正痘病毒而言，属于免疫空白的易感人群。从流行病学上看，猴痘病毒从2017年以来，暴发和流行模式发生明显改变，这可能与1980年后新出生的易感人群数量增多有关。无疑，人群、自然环境和社会环境等因素对猴痘病毒进化和传播模式有不可忽视的影响，未来需要在多学科多领域方面深入研究。

猴痘病毒的传播方式（特别是呼吸道和性传播）以及对特殊人群（包括儿童、老人、孕妇等）的致病力等，都需要密切关注和深入研究。病毒的传播力和致病性与病毒进化密切相关，有必要建立猴痘病毒监测体系，通过持续改进的分子检测技术和高通量测序分析等手段，加强对病毒进化的研究，特别关注病毒在特殊人群（HIV患者、免疫低下人群等）中的进化。同时，实践“同一健康（One health）”理念，开展猴痘病毒的生态监测，关注病毒在人和其他易感动物中的传播和进化。

加强对猴痘病毒基础科学问题的研究，如基因功能、复制特性以及免疫机制等，为抗病毒药物和疫苗的研发提供理论基础。传统上的天花疫苗和抗天花病毒药物，对猴痘也有一定的预防和治疗作用；但两种病毒的的生物学特性和致病特点仍有很多不同，有必要应用新技术手段（如mRNA疫苗技术、人源化单抗技术、新型药物研发技术等），加快针对猴痘病毒的新型疫苗和抗病毒药物研发。

注：本文大部分文字，已在“江苏预防医学”发表。

图4.US-CDC猴痘实验室检测程序