编者按

生物类似药与参照药不可能做到完全一致，那么到底如何来把握相似性呢？FDA在生物类似药指导原则中给出一些原则性建议，并在在实际案例中给出了具体建议。2015年，FDA专家撰文介绍了生物类似药分析相似性的评估策略，总结和梳理FDA的立场以及在具体审批案例中积累的经验。

这篇文章题为“Development of Statistical Methods for Analytical Similarity Assessment”，作者为FDA 药品评价与研究中心（CDER）下属翻译科学办公室生物信息学办公室的Yi Tsong、Xiaoyu Dong 和 Meiyu Shen。2015年9月发表在期刊Journal of Biopharmaceutical Statistics。

一、背景

为评估生物类似药与参照药分析层面相似性，FDA建议建立三级质量参数系统（three tier），通过分析单个质量参数（结构、理化性质、生物活性）与潜在安全性和有效性的影响，来确定其级别，进而按照不同的方法来评估相似性。

2009年BPCIA法案建立生物类似药途径以来，FDA相继发布了相关指导原则：“Scientific Considerations in Demonstrating Biosimilarity to a Reference Product” (2015)、Quality Considerations in Demonstrating Biosimlarity of a Therapeutic Protein Productto a Reference Product” (2015)和“Clinical Pharmacology Data to Support a Demonstration of Biosimilarity to a Reference Product” (Draft Guidance 2014)。在这些指导原则中，相似性这样定义：“that the biological product is highly similar to the reference product notwithstanding minor differences inclinically inactive components” and that “there are no clinically meaningful differences between thebiological product and the reference product in terms of the safety, purity and potency of the product”。

FDA在指导原则中给出了递进原则和建立质量参数分级体系的原则性建议。这篇文章则进一步进行了深入解读。

二、证实相似性的递进策略

FDA希望通过按照递进策略提供“totality-of-the-evidence”，即按照下图的倒金字塔逐步证实相似性，当某个环节存在某些不确定性时，在下一个环节着重分析该不确定性的影响。并在过程中与FDA及时、充分沟通，以便FDA可以更好确认是否有足够证据证实相似性。

三、FDA相似性分析的质量参数分级体系

FDA建议建立质量参数分析体系，对质量参数的风险进行充分评估，根据分级体系使用不同的方法来进行相似性分析。

表一 Three-tier based 质量参数分级体系

3.1 对于Tier 1级的质量参数，FDA建议进行统计学的等效验证

对于Tier 1的质量参数，FDA建议进行等效性验证，类似于仿制药的生物等效性验证。用X_T~ N（μ_T，σ_T²）、X_R~ N（μ_R，σ_R²）分别代表类似药于参照药的参数分布。μ表示平均值，σ²表示方差。我们要对如下假设进行统计验证：

δ 为等效性边界，μ_T、μ_R为测定后的统计值，分析相似性就是是否可以否定H₀，接受Ha。某些情况下，需要进行单边验证：

同样，δ 为等效性边界，μ_T、μ_R为测定后的统计值。分析相似性就是是否可以否定H₀，接受Ha。

双边验证也可以用两个单边验证（TOST）来表示：

为了否定H₀₁、H₀₂假设，可以做如下统计分析：

S_pool²表示样品pool 方差，n表示批次，如果

处在(-δ, δ)范围内，则证明两者具有等效性，置信区间为（1-2α）*100%。

正如在所有等效验证中一样，确定合适的等效界值尤为关键且富有挑战。我们更希望根据既有的经验和生物学的科学性，设定一个合理的等效界值。但实际上，对于生物类似药的开发来说，这并不可行。而且一刀切的等效界值也不适合作为所有的参数，这是由于：

1. 一个生物类似药可能有多个Tier1参数（CQA），每个参数可能有不同的变异性，如果设定固定的等效界值，对于不同的CQA可能需要不同批次数的样品，有时能批次数可能是不可达到的；

2. 同一个参照药可能存在不同的类似药申请企业，不同企业可能设定不同的Tier1参数（CQA），需要一个统一的但非固定的等效界值；

3. 几遍不同企业设定相同的Tier1参数（CQA），其使用的分析方法可能不同，方法的变异性因而也就不同；

4. 生物类似药的批次通常有限，这样一刀切的固定等效界值，会使得通过等效验证的统计功效过低。因此有必要建立一个统计学意义的的等效界值。

考虑到以上原因，在设定等效界值时我们有如下考量因素：

1. 需要为不同变异性的Tier1参数（CQA）设定统一标准的等效界值；

2. 对于有限批次样品的情况，需要达到足够的统计功效来通过等效验证；

在相同的样品容量和变异性条件下，Limentani提出了一个分析化学层面的等效界值设定法（2005）：

δ₀表示预设的可接受偏移值，s*是标准差95%置信上限。t(a,b)是100a-th自由度为b的t分布。Limentani建议对于任何样本容量都采用1-β/2=0.99对于备择假设μ_T-μ_R=δ₀。这样，Limentani法下不论样本量多大，只要平均值差值小于预设的δ₀，99%统计功效通过等效验证。一般认为，Limentani法设定的等效界值太宽泛，而且申请企业也没有动机采用更大的样本量。

为克服Limentani法的缺陷，我们根据小的平均值差值考虑据样本量修正的统计功效，并用样本标准差替代标准差置信上限。这样，统计功效被设计为对样本量大小单调上升的函数。对于申请企业，10批次一般是可能的，当批次少于10批时，仍然能达到50% （4批次时统计功效为65%）以上的统计功效来通过等效验证，前提是平均值差值小于目标相似性范围。如果没有预定的等效界值信息，δ₀=0。经过FDA生物学家和统计学家的讨论，对于给定的样本批次，初始统计功效值如下表：

表二 统计功效与批次数关系

统计功效值是通过一个明确的函数计算出来的，变量为平均值差值、变异性、类似药批次、参照药批次。

为了对于任意批次的样本都能计算统计功效，我们对上表中的数字进行单调指数函数的拟合，得到如下函数：

根据这个函数，得到下图：

接下来我们需要确认目标相似范围Δ0以确定等效界值的系数f，δ= f × σR，使得对于样本量n的情况，在实际平均值差值为Δ0时，统计功效达到给定值：

U2符合2（n-1）自由度的Chi-square分布，Φ为正态分布的累积概率函数，E是Φ(U2)的期望值。根据模拟结果和讨论，FDA生物类似药分析方法工作小组1/8σ_R.作为目标平均值差值。在此条件下，等效界值的系数值f与批次的关系如下表（δ= f × σR）：

从表中可以看到，批次越少，f越大，即等效界值越宽泛，这并不意味着可以用更少的批次来验证等效性。因为，批次越少，统计功效就越低。同时，为了使得等效验证更简单，我们建议采用固定的f值而调整α，选取等效界值δ= 1.5 × σ_R，如此，等效假设变为：

如上文所述，等效验证可采用双边验证，（1-2α）*100%为置信水平。当给定等效价值δ= 1.5 × σ_R，置信水平（1-2α）*100%与批次数关系如下表：

表四 置信水平与批次数的关系

3.2 对于Tier 2的质量参数，FDA建议进行参数范围验证

对于Tier 2的质量参数，可以采取质量参数范围法：即90%的类似药批次参数落在参考药参数范围内。如果参照药为X_R~ N（μ_R，σ_R²）分布，参数范围为μ_R±xσ_R。对于参照药本身，对于参数范围μ_R±σ_R，覆盖了68%的参照药；对于参数范围μ_R±2σ_R，覆盖了95%的参照药；对于参数范围μ_R±3σ_R，覆盖了99.7%的参照药，对于参数范围μ_R±4σ_R，覆盖了99.99%的参照药。我们建议用Mean ± kSD（平均值±k倍标准差）设定质量范围，在目前的几个案例中，通常取k=3。根据样本量系数具体选用多少，应提前与FDA达成一致。有些参数的特点不适用参数范围法，可以根据实际情况采取预设范围法。

四、Three-Tier based system质量参数分级体系（ABP501）

本文以山德士开发的Humira类似药ABP501为例，梳理其质量参数分级体系，供大家参考。

五、Tier 1参数的统计分析案例（Zarxio、ABP501）

5.1 山德士Zarxio的Tier 1参数（CQA）相似性分析

2015年3月6日，FDA批准了第一个生物类似药来自山德士的Zarxio，参照药为安进的Neupogen。

分析相似性在Zarxio、美国市场Neupogen、欧洲市场Neupogen间进行，双双比较。Tier 1（CQA）参数确定为生物活性（bioactivity）和含量（Cotent）。生物活性用与内部标准品相比的百分比来表示，含量用与标示量600mg/ml的百分比来表示。等效界值均设定为1.5σ_R。

对于生物活性，山德士测定了15批Zarxio、15批美国市场Neupogen、34欧洲市场Neupogen。

美国市场Neupogen和欧洲市场Neupogen的σR分别为6.21%和6.71%。请注意欧洲市场Neuppogen有34批，超过Zarxio的两倍，在分析过程中被分为两部分，一部分15批用来估计平均值差值，一部分19批用来估计等效界值。这两部分的平均值差值和方差相同。这样，Zarxio与美国市场Neupogen的等效界值为δ = 1.5× 6.21 = 9.32，Zarxio与欧洲市场Neupogen的等效界值为δ = 1.5 × 6.71 = 10.07。对zarxio的分析发现，置信区间完全落在等效界值范围内，证明Zarxio与美国市场Neupogen、欧洲市场Neupogen均为等效。结果如下：

对于含量，山德士测定了20批Zarxio、12批美国市场Neupogen、49批欧洲市场Neupogen。

美国市场Neupogen和欧洲市场Neupogen的标准差σ_R分别是1.51、2.17。同样，欧洲市场Neupogen分为两部分，一部分20批用来估计平均值差值，一部分29批用来估计等效界值。对于Zarxio vs 美国市场Neupogen，等效界值为δ = 1.5× 1.51 = 2.26，对于Zarxio vs 欧洲市场Neupogen，等效界值为δ = 1.5× 2.17 = 3.23。

5.2   山德士ABP501Tier 1参数（CQA）相似性分析

2016年月12日，FDA专家委员会26:0投票支持批准山德士阿达木单抗ABP501，参照药为艾伯维的Humira。

经过与FDA专家协调一致，确认Tier 1参数（CQA）为效价（通过细胞凋亡抑制法测定）和对游离TNF-α的亲和力。

对于游离TNF-α亲和力，山德士测定了10批ABP501、10批美国市场Humira、10批欧洲市场Humira。ABP501在90%置信水平的置信区间，完全落在美国市场Humira的等效界值范围内（平均值差值在1.5倍标准差范围），因而证实两者等效。

对于效价，安进测定了10批ABP501、21批美国市场Humira、18批欧洲市场Humira，结果发现ABP501在90%置信水平的置信区间，完全落在美国市场Humira的等效界值范围内（平均值差值1.5倍标准差范围），因而证实两者等效。

六、Tier 2参数相似性分析案例（ABP501）

对于Tier 2的质量参数，FDA建议使用参数范围法分析相似性。Quality Range = Mean ± X*SD，以ABP501为例，系数选择3，即类似药的参数应有90%（比例，非统计学的置信水平）批次落在参照药平均值±3倍标准差范围内。如ABP501某些参数使用批次为10批，意味着允许一个批次超出±3倍标准差范围，可认为与参照药相似。如果不到10批，意味着所有批次结果都不能超出范围，否则就认为该参数不相似。

表十 ABP501 部分Tier 2 参数相似性分析

七、总结与展望

目前的统计学方法存在一些挑战，如参照药的选择，如果集中在一段时间购买，那么 样本量可能无法充分估计其变异性。而类似药的批次通常非常有限，目前的方法在提高相似性验证的通过率方面起到了一定作用，但这个方法建议的基础（如Tier 1参数的1.5，Tier 2参数的3.0等）是基于FDA科学家的模型运行结果，更多的实际经验还要等到生物类似药上市以后才能获得。FDA会根据需要和实际情况进一步对该方法进行修正。类似药开发企业也应更多搜集相关数据，并与FDA充分沟通以最大程度避免相似性分析过程出现Type I 的验证错误。

How similar is similar？这一次是困扰生物类似药开发企业的问题。本质上仍然是如何将统计学工具更好的应用到相似性评价中，一方面需要更好的统计模型，另一方面更需要积累数据以确认生物类似药相关质量参数（QA）与临床outcome的关联性。尽管类似药监管体系发展较晚，FDA近年来仍做出了积极努力。这些原则和经验，值得国内生物医药行业参考借鉴。

FDA专家组非常重视统计学工具在生物类似药分析相似性验证中的应用，国内生物类似药的开发在这方面还存在许多差距：诸如分析相似性的工作不足、参照药批次有限、统计学工具应用不充分不够科学等。随着国内生物制药行业的发展，类似药竞争激烈，一个重要出路就是角逐全球市场；真正意义的新药则研发投入巨大，国内市场难以回收成本，必然也要参与全球市场竞争。如此，面对全球竞争的必然方向，国内企业应该及早看齐国际标准，提高国际竞争力。

参考资料

1. Developmen tof statistical methods for analytical similarity assessment(2015)；

2. Assessing Analytical Similarity of Proposed Amgen Biosimilar ABP 501 to Adalimumab(2016)；

3. Statistical Considerations in Setting Product Specifications(2015)

4. FDA官网

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