封面 | 飞秒激光“大显身手”，精准捕获单细胞

《中国激光》“生物医学光子学”专题刊第4期于第49卷24期出版，本期封面文章来自中国科学院沈阳自动化研究所王晓朵副研究员和东北大学孙丽娜副教授的研究论文，针对高通量单细胞捕获的应用需求，提供了一种简便、高效的单细胞阵列原位捕获方法。

封面解读：封面呈现了飞秒激光制备的微柱阵列在毛细力驱动下进行自组装，进而实现单细胞阵列原位限域捕获的过程。图中每个高纵宽比的微柱均由单个飞秒激光脉冲进行多光子聚合而成。将显影后的图案化微柱阵列置于细胞溶液中，基于溶液挥发过程中微结构间的毛细作用力调控，便可以实现单细胞阵列的高通量、原位捕获。该单细胞阵列的原位限域捕获方法有望应用于生物医学领域单细胞行为分析、药物筛选等相关研究。

文章链接：杨婷, 孙丽娜, 代国朋, 吕孝峰, 王晓朵. 基于多光子聚合微笼阵列的单细胞捕获方法[J]. 中国激光, 2022, 49(24): 2407104

研究背景

正如没有完全相同的两片叶子一样，世界上也没有一模一样的两个细胞。

细胞作为生命的最小单位，承载着许多绚丽生命现象的发生。每个细胞都是独一无二的，异质性是细胞的天然特性之一，看似相同的一群细胞，其内部有可能存在着本质的差别。研究单个细胞可以很好的认识到细胞异质性，更好的对疾病进行解读。单细胞分析对细胞异质学、遗传代谢、基因工程领域及毒性检测方面的研究具有重要意义，而单细胞分析的前提是捕获单个细胞并形成单细胞阵列。

目前，常用的细胞捕获方法大多数与微流控技术相结合，主要包括单光束激光法、介电泳、声镊及磁镊等。介电泳捕获的原理是使细胞在非均匀电场极化，从而在介电泳力的作用下运动或者被势阱限制。声镊则是利用超声驻波产生声压，实现对单细胞的操纵和捕获。显然，利用上述方式进行细胞捕获后，维持细胞被捕获的状态需要外加的电场和磁场等。一旦取消外加物理场的作用，细胞很容易回到无序状态，不利于后续进一步的表征和分析。因此，发展一种类似于微结构的方式，便于实现捕获后细胞的固定、培养和观测是单细胞分析亟需解决的难题。

创新工作

中国科学院沈阳自动化研究所王晓朵副研究员和东北大学孙丽娜副教授针对高通量单细胞捕获的应用需求，基于飞秒激光单脉冲多光子聚合技术，结合毛细力自组装原理，提出了一种基于微柱阵列自组装的单细胞阵列限域被动捕获方法，实现了人乳腺癌（MCF-7）单细胞阵列的高通量原位捕获。该方法可有效产生大规模的单细胞阵列，在单细胞水平特异性分析和药物筛选等领域具有良好的应用潜力。

针对多光子聚合轴向加工效率较低的问题，团队提出了基于高纵宽比聚焦光斑进行微柱单脉冲多光子聚合加工的方法，实验原理如图 1（a）所示。激光光束经物镜聚焦形成呈狭长的椭球形分布的高纵宽比聚焦光斑。向上移动光刻胶样品时，经过聚焦光斑区域且满足聚合能量阈值的光刻胶发生多光子聚合，形成高纵宽比微柱。通过调节椭球形光斑浸没到光刻胶中的高度，可实现聚合微柱高度和直径的调控。该方法中，每根微柱的曝光时间仅为单个飞秒激光脉冲宽度，即217 fs，可以极大提高微柱的轴向加工效率。

图1 单脉冲多光子聚合实验原理及加工结果。（a）单脉冲多光子聚合原理示意图；（b）（c）单脉冲多光子聚合加工得到的高度为5 μm和40 μm的4×4微柱阵列；（d）入射激光功率为0.4 W-0.8 W时，微柱直径随高度的关系变化曲线

当相邻微柱间的距离足够近时，微柱受到的静毛细力大于弹性恢复力，微柱间发生毛细力自组装，形成微柱簇结构。图2中微笼结构由微柱自组装而成，从微结构扫描电子显微镜（SEM）图像可以看出，自组装的微柱紧密连接在一起。实验结果表明，将该结构再次浸润在液体环境中时，自组装状态仍可继续保持，可以在无外场作用力的条件下，稳定维持单个细胞的捕获状态。

图2 基于毛细力自组装的图案化微结构阵列SEM表征结果，微柱聚合的激光功率为0.4 W。（a）由4个微柱自组装形成的微笼结构阵列，右上角为单个微笼的侧视放大图；（b）由8个微柱自组装形成的“四叶草”微结构阵列，右上角为单个微结构的侧视放大图

在上述基础上，开展基于毛细力自组装原理的单细胞阵列原位捕获实验验证。优化微柱间距和高度后，在由微柱组成的微结构阵列上接种MCF-7细胞。实验结果表明，被捕获细胞的尺寸与微结构单元的直径相近，且每个微笼结构中的细胞数量均为一个，该方法可以有效实现单细胞阵列的高通量捕获，不同微结构捕获的单细胞阵列如图3所示。由于自组装结构仅可以捕获于微笼直径相近尺寸的细胞，因此捕获的细胞直径较为统一，可为不同直径的细胞分选提供新的方法。

图3 细胞原位捕获图。(a)(b)(c)分别是四个微柱结构原位捕获细胞的荧光图像、光学图像及SEM图；(d)(e)(f)分别是六个微柱结构原位捕获细胞的荧光图像、光学图像及SEM图；(g)(h)(i)分别是八个微柱结构原位捕获细胞的荧光图像、光学图像及SEM图

总结

团队基于飞秒激光单脉冲多光子聚合技术，结合毛细力自组装原理，实现了 MCF-7单细胞阵列的高通量原位捕获。所提方法为不同尺寸细胞的分选、捕获及原位观测提供了一种较为简便的方法，有望应用于生物工程、医药分析等领域。后续将基于单细胞原位捕获方法，开展微结构对单细胞行为特性影响的表征和细胞限域生长特性的相关研究。

作者简介

通讯作者王晓朵，中国科学院沈阳自动化研究所，副研究员，硕士生导师。主要从事飞秒激光微纳制造和光学超分辨成像研究，主持并参加多项国家自然科学基金项目、中国科学院科研仪器装备项目和辽宁省自然科学基金项目。发表学术论文33篇，申请发明专利4项。相关研究成果发表在Advance Sciences, ACS Applied Materials & Interfaces, Lab on Chip, Optics Express，Optics & Laser Technology等国际期刊上。

通讯作者孙丽娜，1977年7月出生，工学博士。东北大学机械工程与自动化学院副教授、硕士生导师。主要从事X射线安全检查检测技术、高性能稀土闪烁陶瓷材料、先进光电功能材料等领域的研究。承担、完成国家基金面上项目、国家重大仪器专项、辽宁省科技攻关项目等20余项。发表学术论文50余篇，授权专利8项，软件著作权1项。

课题组简介

中国科学院沈阳自动化研究所微纳米机器人课题组成立于2002年，隶属于机器人学国家重点实验室。课题组以微纳制造为学科发展目标，为微纳米科学研究和应用、纳米器件制造提供新的科学实验研究理论方法和技术途径。近年来，在微纳光学与生物传感领域开展了一系列的研究，并取得了具有较高影响力的研究成果。