Cell Research | 诺禾最新力作：单细胞测序发现肾细胞癌干细胞驱动基因

原创 2016-12-28 陈蕾蕾 诺禾致源

近日，中国科学院生物物理研究所李翀博士，西安交通大学第一附属医院李磊博士，深圳大学附属罗湖医院吴松博士等联合诺禾致源生物信息科技有限公司信息分析人员，利用单细胞外显子组测序，将KCP、LOC440040和 LOC440563 突变确定为肾细胞癌干细胞中的驱动因子。文章发表在一区杂志Cell Research（14.812）。

研究背景

肾细胞癌（Renal cell carcinoma，RCC）占成人恶性肿瘤的3%，以及肾肿瘤的90%～95%。肿瘤干细胞（Cancer stem-like cells，CSCs）在肾癌发生、发展以及耐药性的产生中扮演着至关重要的角色。已有研究表明，RCC是一种遗传学明显不同的成人癌症，具有相对较低的突变率。测序研究揭示RCC患者之间共有一些常见的体细胞突变。最近，单细胞外显子组测序已被用于评估多类肿瘤的体细胞突变，然而尚未系统地运用于识别肾细胞癌肿瘤干细胞的关键驱动基因。

研究策略

选样： 单细胞，Tumor-Normal成对组织

测序策略：外显子组测序（140×）

研究结果

1. 验证CD133⁺ RCC 细胞具有干细胞的特征

从一个RCC病人体内分离了CD133⁺ RCC 细胞以及CD133^– RCC 细胞，发现只有CD133⁺ RCC 细胞具有 sphere-forming capability。之后将CD31^–CD45^– ，CD31^–CD45^–CD133^–，或者CD31^–CD45^–CD133⁺ RCC细胞分别皮下注射到NOD/SCID小鼠体内，发现几乎所有注射10000个CD31^–CD45^–CD133⁺ 细胞的小鼠都可看见明显的肿瘤，即使只注射10个细胞，也有将近20%的小鼠体内可见明显的肿瘤。而几乎50%以上注射其它两类细胞的小鼠体内都未发现肿瘤。综上，确认CD133⁺ RCC细胞具有干细胞的特点。

2. 外显子组测序发现关键驱动基因

从同一个病人体内分离10个CD133⁺ RCC细胞，10个CD133^– RCC细胞和10个正常的肾细胞，进行单细胞外显子组测序。同时也取癌组织以及癌旁组织进行了外显子组测序。最终在组织中发现160个somatic SNVs，在20个肿瘤单细胞中发现297个somatic SNVs。常见的RCC突变基因，诸如VHL，BAP1，TRA以及CHD4均出现在组织以及单细胞中，说明该方法的可靠性。发现的大部分突变集中在CD133⁺ RCC细胞中（图1A），其中，KCP基因的c.A241T>p.R81W突变，LOC440563基因的c.G316A>p.G106S突变，以及LOC440040基因的c.A406T>p.N136Y 突变，只存在在CD133⁺ RCC细胞中，且之前并未被报道过。并且发现，C/G>T/A，A/T>C/G 以及A/T>G/ C 三类突变在肾细胞癌中较为常见，相较于CD133^– RCC细胞，A/T>T/A突变在CD133⁺ RCC细胞中更为常见（图1B）。

图1  体细胞突变全景图（A）及SNV突变频谱图（B）

3. 确定单细胞进化来源

通过PCA分析，发现正常肾细胞与CD133^– RCC细胞靠的更近，CD133⁺ RCC细胞散乱分布且离正常肾细胞与CD133^– RCC细胞较远（图2A）。同时进化树显示，三类细胞分别聚在一起，且正常肾细胞与CD133^– RCC距离更近（图2B）。综上确定CD133⁺ RCC细胞更有可能是由肿瘤细胞进化而来并非正常细胞。

图2  PCA分析（A）及进化树分析（B）

4. 评估不同突变促进肿瘤形成的能力

选取了20个突变，分别利用CRISPR-Cas9技术导入到RCC 786-O细胞中，发现 KCP 基因的突变有效促进RCC 786-O细胞成球。之后，分别将余下的19个基因与 KCP 基因搭配导入细胞中，发现LOC440040 基因与 KCP 基因的协同突变显著增强细胞成球能力。以此类推，最终确定 KCP 基因、LOC440040 基因、LOC440563 基因三者的协同突变，效果最佳。并将带有三者突变的细胞导入小鼠体内，与野生型细胞相比，更多小鼠检测到了肿瘤。

5. 研究三类突变在病人体内出现的频率及相应病人的复发情况

选取了57个病人，对 KCP 基因、LOC440040 基因、LOC440563 基因三个突变位点进行了sanger测序，结果显示超过20%的病人至少携带一个突变（图3A），5.2%（3/57）同时携带这三个突变，这些病人切除原发瘤以后，肿瘤复发时间明显短于其他人（图3B）。

图3  不同突变出现的频率（A）及携带不同突变肿瘤的复发时间（B）

研究结论

通过单细胞外显子组测序研究表明，CD133⁺ RCC细胞具有CSCs特性，并可能来源于癌细胞，并非正常肾细胞。KCP、LOC440040 和 LOC440563 突变——目前至少存在于20%参与调查的患者中，构成了强大而危险的驱动因子，促进肾细胞癌癌细胞重编程为CSCs。因此，它们可以作为RCC重要的预后因素和治疗靶点。

参考文献

LiC, Wu S, Yang Z, et al. Single-cell exomesequencing identifies mutations in KCP, LOC440040,and LOC440563 as drivers in renal cell carcinoma stem cells[J]. CellResearch, 2016

癌症业务线  陈蕾蕾丨文案

王   迪丨编辑