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土鳖博士如何把Cas9玩出变形金刚的感觉? 精选

已有 15417 次阅读 2016-10-3 21:09 |系统分类:科研笔记| 科研心得

土鳖博士如何把Cas9玩出变形金刚的感觉?

一稿难投三波折,砥砺吾心炼坚强!

傍晚,文章online了,曾经幻想过无数次这一时刻,觉得文章online后应该好好休息一下,去爬爬山看看景,或者去风景区看看人海,至少也得去中关村吃一顿好吃的,可真的online后,似乎觉得这件事情已经过去了很久,一如往常做完实验,赶在食堂关门之前,饱饱的吃上一顿,迎接晚上的实验,走在回去的路上,忽然觉得进到这个校园竟然都三年了,三年前自己穿个拖鞋,背个书包就跑到北京,说要来找实验室,找学校准备保研,这一切仿佛还都在昨天,没想到一眨眼,三年就过去了。

三年足够一个初中生走向高中。

三年足够一个硕士毕业。

三年很长,三年里,我究竟学到了什么?难道所有的奋斗,真的只是为了paper上的一个名字?

下一个三年我该怎么去奋斗?!

今天online的这个工作,持续了接近两年,忽然想从头到尾把整个心路历程记下来。

真正说起这个故事,还是得从三年前那个那个穿拖鞋的我说起,那个时候自己还是大四,刚刚被清华合成与系统生物学中心录取攻博,合成生物学?什么是合成生物学?这个领域究竟是什么样一个情况?既没有做过iGEM(国际遗传学大赛,很多后来在合成生物学领域有所突破的博士,都有着本科iGEM的背景),其实也没有读过几篇文献。

既然都要读博士了,我怎么入手这个领域?

对于一个大四的牛犊来说,也许那个时候,评点一篇CNS的文章就好像如果自己是第一作者分分钟就能做完一样,天不怕地不怕,可能所有新手都有这样一个不切实际的想法,尽快的读完这个领域很多文献。

在川大的望江校区,打印店遍地都是,又都很便宜,自己在pubmed上开始检索起”synthetic biology“,下了不知道多少篇文献,竟然整整打印了四大本,从成都一路读到了北京,我的故事和大多数人一样,也许就前几页读了,后面可能都找不到书了。

是的,虽然我累的满头是汗,把这四大本驼到北京,事实上,自己就是那么好高骛远,也没有读几页。

虽然没有读几页,但是大概还是有了一定的印象,原来合成生物学的很多是生物元件系统的开发,利用不同元件的特性,通过一定合理的设计来实现相应的功能。

其中有一个工作[1]还是稍微有了些印象,讲的是什么样一个故事哪?

这篇文章是合成生物学领域的大牛Pamela Silver发表在Nuclear Acid Research上,

说是,利用一种叫做intein(内含肽)的工具,将另外一种可以定制化结合DNA的蛋白叫做TALE给拆开了,拆开后,这样就可以做多个输入。

之所以对这篇文章看着亲切一些,一来是对内含肽比较熟悉,为什么哪?自己大三时候,突然想学学药学院的课,就选修了一些,其中有一门考试有一个名词解释:intein,看着这个单词,第一次见,跟intron比较像,但是后缀又好像蛋白protein的后,自己就没敢写,了下来,然后回来一,果然是一种蛋白,可以像intron(内含子)生自剪切。

                          1   内含使用范例[2]

正如中两个绿色的部分,内含的N端和C端,其中他可以跟intron一生自剪切,这样就会将两边的蛋白给连接起来。

另外一个比较熟悉的东西是TALE,这个东西很神奇,第一次接触是大三的时候,全国的生物化学与分子生物学年会在成都开,自己偷偷的进去旁听过,其中颜宁的学生邓东,就在报告他们解析了TALE的结构[3],TALE蛋白中间是由一串重复性单元组成,其中每一个重复性单元由两个helix组成,在helix中间的两个氨基酸特异性的识别某个特异的碱基对。然后不同的重复单元识别不同的碱基对,这样就可以定制化的特异性识别某个特异的DNA序列,通过定制化特异的DNA序列,人们可以特异的结合到某个基因组到位置,比如打开某一个基因的表达,或者对某个位置进行切割。

                          图2  TALE 的结构[3]

                          3  TALE行基因切割的模式图[4]

Nuclear Acid Research这篇文章主要是讲,利用intein将TALE蛋白人为的进行拆分,拆分后,就可以变成两个蛋白,而这两个蛋白当遇到的时候,就可以自剪切,从而形成完整的整体,这样就可以实现一个“与门”的逻辑运算。

                         4   利用内含肽对TALE行拆分[1]

当大四候,篇文章,也并未得自己可以利用,然当候,Cas9已经横空出世,各种不同的生物元件在TALE上被证明有效后,就紧接着被转移到Cas9上来,自然一个非常朴素的想法就是intein估计也可以用来拆分cas9,既然一个很简单的想法,自己为什么要follow这样一个idea哪?

就这样,这篇文章,随着尘封的四大本paper,被我遗忘了。

时间就是这样翻过一天又一天。大约一年后,那个时候,我已经正式入学,有一天组会上,导师谢震老师,突然问我们,如果将Cas9应用在生物遗传病的治疗上,你们觉得障碍是什么?

Off-target问题!蛋白太大,无法放到目前被认为安全的腺相关病毒体中!

那么你可以想想法解决?”师说道。

“也许我们可以利用内含肽将cas9拆开,这样就可以放到两个载体里面!”我应声答道,“曾经有一篇silver的文章,就是利用intein将TALE拆开”,我突然想到曾经看到的这篇文章,回答道。

从会室走回实验室的路上,突然叫住我,“大程,你也可以,至少这样就可以通过腺相关病毒递送cas9了!

导师的首肯后,我开始着手设计,正如silver NAR那篇文章中所,将intein放在蛋白较为柔和的区域[3],我选择了713,开始了第一个实验

那个候,刚刚入学,构建质粒还不是那么顺手,摇摇晃晃,总算把构建出来的质粒做出来了。非常不熟练的做了次转染,细胞死的差不多了,但是还活着的细胞竟然展现出可以被切割的活性?

难道说我真的做出来了?

第二天和导师汇报工作,谢震老师也非常激动,他勉励我,继续测试不同的位点,是否可以在不同的位置有类似的结果。

接着弟彭曙光加入个project中来,我一起测试不同位点的切割果。

时间过的很快,眼就要到了春,整整做了一夜实验的我,于在回家前做好了不同拆分位点,用于切割,转录激活,转录抑制的相关结果,腊月28,踏上了回家的火车。

                  图5  将cas9进行拆分后激活基因

事情并不像想象的那么顺利,刚过完春节,忽然看到邮箱里一则pubmed的推送,大名鼎鼎的Zhang Feng,发表了题为:“A Split Cas9 Architecture for Inducible Genome Editing andTranscription Modulation”的工作,这不正是我们想做的吗?

                        图6 可以诱导的拆分cas9[5]

刚刚尝试的我,遇到了第一个打击,其实,这还只是开始。

谢老师勉励我们,既然Zhang Lab采取了直接拆分的方法,还是和我们有所不同,是否可以对两者进行比较?

又过了三个月,我们又完成了相应的比较。除了两段拆分,那么我们是否可以进行三段拆分?

既然我们可以使用intein和直接拆分这两种方法,而且有四个不同的位点,那么是否我们可以一个位点使用intein,另外一个位点直接拆分,这样就可以把cas9拆成三个部分?

                  图7    将dcas9拆成三段

除此之外,既然对于拆分cas9,已有报道,那么是否我们可以利用合成生物学工具,使用基因线路进行优化?

几个月前,课题组刚刚在Nature Chemical Biology 上发表关于使用互抑制子基因线路对细胞进行分类的工作。那么,我们是否继承实验室其他人的基础,应用在我们的工作上?

                        图8 基于TALE互抑制感知shRNA信号[6]

说干就干!

课题组的这份工作是通过感知shRNA信号,控制不同的细胞中表达不同的荧光蛋白。那么是否我们可以控制不同的细胞表达偶联不同效应蛋白结构的C端?

                    图9  基于TALE互抑制 控制dcas9蛋白交换

就在我们第二次决定投稿的时候,没想到第二个打击就来了。

Pubmed再一次推送了一篇发表在Nuclear Acid Research上的文章,相继在scientific report也有一个关于使用intein的文章,我们intein的希望了也落空了!!

当晚导师谢震打来电话,安慰我说,“大程,不要灰心!我们可以继续完善交换cas9结构域的工作”

图10  不同的变形金刚(取自网络)

                    图11   不同的小车比喻不同的cas9,在不同的信号下采取不同的另外一端,实现不同的功能。

Cas9如果未来应用于医疗等应用,对Cas9实现精确的控制是必须的,那么就需要哦实现在特定细胞,表达cas9,甚至于在不同的细胞中表达不同的Cas9!

就好像变形金刚,需要cas9,在不同的环境中,具备处理不同事情的能力!

在连续两次被别人先发表后,终于在今年的春节前进行了第一次投稿!

经过8个月漫长的修改,终于在8月底得到了接受的喜讯!

一稿难投三波折,砥砺吾心炼坚强!

回顾这三年,自己从一个邋遢鬼,变的更加注重细节。

回顾这三年,自己从一个拖延症晚期,变的更加高效。

回顾这三年,自己从急功近利变的更加平静淡然。

回顾这三年,既没有像颜宁施一公的弟子们那样,一年级,二年级甚至本科就可以发CNS那样的成绩,也没有做出多么厉害的工作,只是一步一步的,在艰难中不断的改变那个乱七八糟的自己,在失败中始终不放弃前进的希望,不知道自己未来在科学世界走多远,不想去想什么时候是第二篇paper,只想脚踏实地,每天在失望中寻找希望!

感谢我的导师谢震教授!我人生中第一个paper合伙人-彭曙光!

马大程  实验台前

16.10.3

文章链接:

http://www.nature.com/ncomms/2016/161003/ncomms13056/full/ncomms13056.html

参考文献:

1Lienert F, Torella J P,Chen J H, et al. Two-and three-input TALE-based AND logic computation inembryonic stem cells[J]. Nucleic acids research, 2013, 41(21): 9967-9975

2http://www.contoo.de/en_US/congress/paper/id/1569/c_cult/en_US/lyt/c.html

3Deng D, Yan C, Pan X, etal. Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TALeffectors[J]. Science, 2012, 335(6069): 720-723.

4http://labomics.com/media/wysiwyg/Illustration-of-TALEN-design.jpg

5Zetsche B, Volz S E, ZhangF.  A split Cas9 architecture for inducible genome editing and transcriptionmodulation[J]. Nature biotechnology, 2015, 33(2): 139-142.

6YinqingLi#, Yun Jiang#, He Chen#, Weixi Liao, Zhihua Li, Ron Weiss* and Zhen Xie*.Modular construction of synthetic circuits using TALE transcriptionalrepressors in mammalian cells. Nature Chemical Biology 11(3):207-13.




投稿与审稿
https://blog.sciencenet.cn/blog-3206819-1006543.html

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