（London-science.com原创，网页转载请附带原文链接：http://www.london-science.com/archives/1425，微信转载请联系我们）

Thomas Cech是美国科罗拉多大学的教授，因发现RNA的催化性质而获得1989年的诺贝尔化学奖。同时，他也致力于DNA端粒的研究，并第一个发现了端粒酶的逆转录酶（TERT）。最近，他利用两项最先进的分子生物学技术-CRISPR基因编辑和单分子活细胞成像（Single-molecule live cell imaging），在端粒研究上又取得了重大突破。Thomoas Cech的研究小组在历史上首次观测到了端粒/端粒酶之间的动态交互，并提出了最新的端粒酶运转机制模型。这项研究被刊登在Cell上。

研究背景

长期以来，端粒的研究都集中在两个核心问题：端粒酶如何寻找染色体末端？端粒酶如何促进端粒进行延长？然而，受到成像方法的局限，这些研究只能在细胞的固定（fixed）形态下进行观测，包括使用荧光原位杂交（FISH）和SNAP标记的方法。在这种条件下，细胞都是“死”的，就如同在整个电影中选取定格画面，研究结论自然不够全面。近年来，单分子活细胞成像技术得到了很大发展，为研究分子层面的细胞活动提供了支持。这种基于光阵列的技术可以实时呈现活体细胞内部的影像。不过，利用这种技术来研究端粒酶，依然存在一个障碍：端粒酶的表达量过低，导致无法观测。如果采用过量表达的方法来提高端粒酶的含量，又会迫使所有端粒酶都结合到染色体末端，破坏了自然形态下的运作机理。

Thomas Cech的团队利用当下最热门的CRISPR技术（关注这项技术的介绍，请点击这里：五分钟看懂CRISPR-Cas9），完美的跨越了这个障碍：使用CRISPR-Cas9编辑端粒酶及其相关蛋白的基因，将强力的荧光蛋白基因与目标基因融合。这样一来，荧光蛋白可以提供足够的信号，便能在自然状态下观测细胞中端粒酶的活动了。

研究过程

首先，他们使用了CRISPR-Cas9，把荧光标签DNA插入到三种端粒酶相关蛋白的基因中，构造出三种不同的荧光蛋白，并在HeLa细胞中表达（癌细胞的端粒酶活性不受抑制）：

1. 端粒酶复合物中的TERT使用HaloTag来标记，发出红色荧光

2. 端粒上的TRF2蛋白使用mEOS3.3来标记，在不同波长下发出绿色或红色荧光

3. Cajal Body中的Colin蛋白使用BFP标记，发出蓝色荧光

随后，他们用单分子活体细胞成像来追踪端粒酶在细胞核中的活动路线，以及与其它两者的相互作用。

图片来源：Schmidt et al.(2016).Cell.

在动力学分析，荧光杂交等其它手段的协助下，他们获得了一些关于端粒酶运转机制的重大发现：

1. 传统研究认为，端粒酶仅在细胞分裂的S期比较活跃，大部分端粒酶以固定态都存储在Cajal Body中。然而，这次的研究结果显示，实际上绝大多数端粒酶都以游离态散布在核仁之外的细胞核质中。端粒酶会在细胞核的中迅速进行三维空间中的扩散，来寻找端粒并与之结合。

2. 总体来说，端粒酶存在三种不同的状态：移动性最强的游离态，移动性较差的Cajal Body结合态，以及与端粒的结合态。

3. 端粒酶与端粒的结合存在两种不同的状态：一种是短暂的，弱效的结合，而另一种则是长期稳定的结合。

4. 端粒酶/端粒的动态交互，需要端粒酶TERT蛋白与端粒蛋白TPP1的相互作用来作为媒介。

最后，他们提出了一个崭新的端粒酶的运作模型，很好地解释了前文提到的两个核心问题。这个模型共分为三个步骤：

1. 端粒酶在细胞核内进行三维扩散，搜索端粒。

2. 作为媒介，TERT蛋白会与TPP1蛋白结合-这使得端粒和端粒酶在S期进行大量的短暂不稳定结合（作用时间小于1秒，S期进行上千次）。这种“探测”式的结合，并不会构成稳定的最终形态。

3. 只有当端粒和端粒酶的结合处位于DNA末端时（暴露出3’单链DNA，即需要延长的位点），稳定的结合才会形成，端粒得以进行下一步的延长。形成稳定的结合是一个缓慢的过程。“探测”活动的进行会使3’单链处的端粒酶浓度上升，从而促进稳定结合的形成。

同时，基于该模型的估算，在人体细胞中，端粒酶可以在S期添加50-200个核苷酸到端粒上。而端粒的缩短速度是每个细胞周期减少50个。端粒酶完全有能力承担端粒修复的任务。

研究意义

端粒酶和端粒，是调控细胞增殖的核心机制。细胞的生死，很大程度上掌握在端粒酶的手中。

细胞在进行有丝分时，滞后链（lagging strand) 需要通过合成冈崎片段来完成-这就许多RNA引物(RNA primer)作为引导。然而，当复制进行到滞后链的末端时，由于缺少RNA引物，导致最后一小段DNA无法被复制。因此，第二代DNA总是会比第一代短。这肯定是不利于遗传物质保存的，所以真核动物进化出了端粒来保护DNA缩短的问题-由TTAGGG重复片段组成的DNA末端区域。端粒酶会将这些片段在DNA合成结束时添加到新的子链上。这样一来，每次被缩短的其实就是端粒片段-由于这些是非转录DNA，所以不会对整个基因组产生影响，同时也保护的染色体的稳定性。

然而，端粒酶并不能无限制的修复端粒。研究表明，由于在正常细胞中端粒酶的活性被抑制，所以修复速度远远跟不上损耗速度，端粒依旧会缩短，直到无法保护DNA-这也就达到了细胞繁殖的极限：Hayflick limit。对于人体细胞来说，经过40-60次分裂，端粒就会彻底失去保护作用，从而进入细胞凋亡的过程。然而，对于癌细胞来说，这个界限却不存在。端粒酶不会受到抑制，从而无限制的修复端粒，使细胞获得永生性。

如果能抑制端粒酶的活性，就可以十分有效地抑制癌细胞的增殖。但是，由于对端粒酶的工作机理缺乏全面的认知，世界上还没有高效的端粒酶抑制因子。如今，Thomas Cech的研究为新型抗癌药物又点亮了希望之光-这个新的动态模型可以帮助科学家们鉴别出最有效的端粒酶抑制因子，并筛选出潜在的抗癌药物。

同时，Thomas Cech也指出，这项CRISPR与活细胞成像技术的完美结合，也为显微学提供了非常有价值的参考。不仅仅在端粒研究领域，其他领域的科学家们也可以利用这种组合技术来探索更多分子生物学的运作机理，比如不同蛋白间的动态交互。这种研究方法有希望帮助科学家们解开更多分子生物学研究的难题。

参考资料：

Schmidt et al., Live Cell Imaging Reveals the Dynamics of Telomerase Recruitment to Telomeres, Cell (2016).