近日，美国Memorial Sloan Kettering Cancer Center的研究人员利用CRISPR/Cas9技术定点构建嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor CAR）T细胞（CAR-T细胞），从而增强小鼠体内的肿瘤抑制效应。这一发现揭示了CART免疫疗法中调控CAR表达的重要性，展示了利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术推动肿瘤免疫疗法的潜力。
在急性粒性白血病小鼠模型NALM-6中，研究人员构建了靶向TRAC基因第一外显子的guide RNA （gRNA）和包含CD19-1928z CAR的AAV载体 （Fig 1），与Cas9 mRNA共同导入T细胞后，成功构建了TRAC-CART。这项新策略的要点为2-in-1，即同时进行T-cell receptor (TCR) 敲除和CART敲入（Fig 2）。这也是首个定点于TRAC、利用TRAC自身启动子进行转录的CAR-T，在小鼠整体实验中表现了出乎意料的抗肿瘤特性，显著延长了小鼠的生存期（Fig 3）。
Fig1 基于CRISPR/Cas9技术，将AAV中包含的目的序列整合入TRAC基因组中，受TRAC内源启动子调控，并阻断TRAC转录翻译成TCR蛋白。
Fig2 在CAR表达的T细胞中，TCR水平被降低。
Fig3 TRAC-CART在小鼠整体实验中表现了出乎意料的抗肿瘤特性，显著延长了小鼠的生存期。肿瘤细胞为GFP+CD19+细胞。
进一步研究表明，与逆转录病毒过表达CAR的T细胞（RV-CART）相比，TRAC-CART能够持续更长的时间地杀死肿瘤细胞，这是因为它们延迟分化，也更不容易耗竭。一旦接触抗原，RV-CART会在5天内激活和分化（Fig4），CD3ζ ITAM被大量磷酸化，下游信号转导系统持续激活（Fig5）；与之不同的是，TRAC-CART仍保持未转化状态，CAR的表达维持在基础水平，表现出极强的肿瘤抗性（Fig6）。并且，传统的CART在构建17天后，超过50%的T细胞会大量表达PD-A，LAG3和TIM3，对T细胞的肿瘤免疫进行“调停”，而只有少于2%的TRAC-CART表现出这一性状 （Fig7）。
Fig4 RV-CART在接触抗原后快速分化，形成效应T细胞，而RTAC-CART更接近与未分化状态。其中CD25和CD69表达水平代表了T细胞的激活，CD62L代表T细胞分化为记忆T细胞。PD-A，LAG3和TIM3表达水平与T细胞杀伤肿瘤能力呈负相关。
Fig5 RV-CART中CART高表达，CD3ζ ITAM大量磷酸化，而RTAC-CART维持CART表达在基础水平，且对CD3ζ ITAM磷酸化没有影响，不增强下游信号转导途径。
Fig6 反复接触抗原后，RV-CART分化和激活明显加快，转录因子T-bet，EOMES和GATA-3的表达水平显著升高，细胞因子IFNg，TNFα和IL2分泌增加，而TRAC-CART仍在较长时间内维持未分化状态。CD45RA与CD62L表达水平与T细胞分化程度相关。
Fig7 TRAC-CART中免疫调节因子PD-1，LAG3和TIM3的表达量显著低于RV-CART，表明TRAC-CART能够更长时间地杀灭肿瘤细胞。
改变RV-CAR转染T细胞的剂量，使RV-CART中CAR的表达水平与TRAC-CART一致，前者仍明显加快T细胞激活和分化（Fig8），揭示了动态调控CAR表达水平在T细胞抗肿瘤作用中的重要性。研究者们构建了定向于基因组不同位点或利用不同启动子的CART（Fig9），与TRAC-CART作用模式进行比较，发现只有TRAC-CART具有分化晚，消亡迟（Fig10），CAR表达水平低（Fig11）三个特性，且只有TRAC-CART具有强效肿瘤免疫效应（Fig12）。
Fig8 在较低水平RV-1828Z转导的T细胞中，细胞激活和分化仍比TRAC-CART快。
Fig9 研究者们构建不同CART的策略，包括定位于基因组其他位点，使用内源性或外源性启动子等。
Fig10 相较于其他构建的CART，TRAC-CART具有分化晚，消亡迟的特性。
Fig11 TRAC-CART的CAR表达维持在基础水平。
Fig12 只有TRAC-CART变现出显著的肿瘤抗性。
T细胞接触抗原后，细胞表面的CAR內吞，随后在细胞内被降解（Fig13），表明为达到对肿瘤细胞的长效免疫，CAR的mRNA表达量和从CAR mRNA重新合成蛋白的过程需要精确调控。研究者发现只有TRAC-CART在未接触抗原时维持CAR基础水平表达（Fig14），且反复接触抗原后CAR表达水平仍保持稳定（Fig15），揭示了启动子强度和转录水平的精确调控是调节CAR表达的重要环节，在构建高效CART中至关重要。
Fig13 T细胞接触抗原后，细胞表面标记GFP的CAR內吞，随后被降解。LNGFR为AAV载体上的一个独立标记，LNGFR高表达显示转录水平无抑制。
Fig14 TRAC-CART在未接触抗原时维持CAR基础水平表达
Fig15 TRAC-CART接触抗原后CAR表达水平仍保持稳定。（B2M-CART接触抗原后CAR表达水平也维持稳定，推测可能是其基础水平CAR过低，不足以产生强大的肿瘤杀伤作用）
论文通信作者、斯隆凯特林癌症纪念中心基因转移与基因表达实验室科学家Michel Sadelain博士说，“癌细胞总是无休止地试图躲避治疗，因此我们需要能制造出够与它们相匹配的并且比它们活得更长的CAR-T细胞。这一新的发现证实我们可能能够利用基因组编辑的力量内在地改进这些‘活细胞疗法’。我们迫切地持续探究基因组编辑技术如何可能给我们提供下一代CAR-T细胞疗法。” Sadelain博士和他的团队旨在在临床试验中探究这些利用CRISPR/Cas9构建出的CAR-T细胞的安全性和疗效。定位于TRAC的CART构建策略可能提供更安全、更高效的治疗性T细胞，在临床抗肿瘤试验中拥有巨大潜力。目前很多科学家们利用基因编辑技术来进行人类临床试验，其中包括肿瘤细胞治疗大牛Carl June进行的一项研究，他们当时利用基因编辑技术来帮助患者抵御HIV，他同时也是美国CRISPR–Cas9修饰免疫细胞进行癌症治疗的科学委员会顾问。
参考资料：
（未止科技原创，转载请联系我们。原文：CRISPR与免疫治疗）
https://blog.sciencenet.cn/blog-3160644-1036592.html
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