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Nature Plants：杨树维管形成层活性的表观遗传与转录协同调控机制

已有 4544 次阅读 2023-1-11 09:32 |个人分类:提纲挈领|系统分类:论文交流

林木通过多年的侧生生长产生大量的木材，因此是研究木材形成的最佳系统。在林木茎维管分生组织中，纺锤状原始细胞（fusiform initials，即干细胞 stem cells）具有自我更新的能力，并能够分化形成导管（vessels）、纤维（fibres）和射线（rays）以增加茎直径，形成木材。其中，纺锤状原始细胞是木质部和韧皮部的唯一来源细胞类型。早在1873年，Sanio就根据欧洲赤松（Pinus sylvestris）中的研究，提出纺锤状原始细胞在分化形成导管和纤维组成木材之前，会自我更新并分裂形成大约含有8层维管形成层（vascular cambium）细胞层，组成了增殖区（proliferation zone）。而后，这一现象在被子植物和裸子植物中被广泛证实具有普遍性。然而，相比于茎尖（SAM）和根尖分生组织（RAM）中分别由WUS和WOX5介导的干细胞稳态调控机制解析，WOX4介导维管形成层发育在木材形成中的调控机制研究相对滞后，尤其是其表观调控机制并不清楚。

2023年1月9号，东北林业大学李伟教授研究组在Nature Plants上在线发表了题为“Cell-type-specific PtrWOX4a and PtrVCS2 form a regulatory nexus with a histone modification system for stem cambium development in Populus trichocarpa”，揭示了一个“tetramer-PtrWOX4a”系统协调遗传和表观调控以维持杨树木材形成中维管形成层发育的分子机制。

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首先，作者结合激光捕获显微切割和转录组测序的方法，鉴定了95个在杨树维管形成层中特异性高表达的转录因子，命名为PtrVCS1-95（图1）。按照表达量排序，排第一位的PtrVCS1就是PtrWOX4a基因，而排在第二位的PtrVCS2基因隶属于ZF-HD转录因子家族。

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图1. 毛果杨维管形成层特异性表达转录因子的鉴定

其次，作者通过在杨树中过表达PtrVCS2基因，发现其能够明显阻碍杨树的高生长和增粗生长（图2a,b）。茎横切面显示过表达PtrVCS2基因导致维管形成层的细胞层数减少（图2c,d）。PtrVCS2具有一个同源基因PtrVCS2-h，虽然不是VCS，但其在形成层、木质部和韧皮部中高表达，并且在形成层中与PtrVCS2具有类似的表达强度，过表达PtrVCS2-h会导致与PtrVCS2类似的表型。同时，ptrvcs2单突与野生型（WT）表型无明显差别，但是ptrvcs2 ptrvcs2-h双突植株的茎直径明显增加，且维管形成层的细胞层数增多（图2e-h）。因此，这些研究结果表明PtrVCS2基因在杨树维管形成层的细胞增殖方面存在特定功能，且PtrVCS2和PtrVCS2-h之间存在功能冗余。

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图2. PtrVCS2在毛果杨维管形成层增殖中的功能鉴定

然后，作者通过WT和OE-PtrVCS2的比较转录组分析和染色质免疫共沉淀测序，共鉴定了905个基因受到PtrVCS2的转录抑制或激活（图3a）。其中，作者发现PtrVCS2过表达能够抑制PtrWOX4a基因的转录，并通过qRT-PCR、茎木质部原生质体系统和原位杂交实验验证了这一发现（图3b,d,e）。而且，在ptrvcs2 ptrvcs2-h双突植株中，PtrWOX4a基因的转录水平增加了约1.6倍（图3c）。
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图3. PtrVCS2调控毛果杨维管形成层中PtrWOX4a的表达

接着，作者为了验证PtrWOX4a与PtrVCS2在杨树维管形成层细胞增殖中的关联，在WT中分别过表达PtrWOX4a基因和敲除PtrWOX4a/b基因。结果显示，在OE-PtrWOX4a植株表现出维管形成层细胞层数的增多，相比于WT多出了4～6层细胞（图4a,b）。同时，ptrwox4a ptrwox4b双突导致维管形成层发育严重缺陷，仅剩1～2层维管形成层的细胞层（图4c,d）。该表型与OE-PtrVCS2株系的表型类似，且OE-PtrVCS2中PtrWOX4a表达丰度降低，暗示PtrWOX4a与PtrVCS2存在调控关联。
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图4. PtrVCS2调控毛果杨维管形成层中PtrWOX4a的表达

再者，由于PtrVCS2蛋白仅含有ZF而不含HD结构域，因此作者推测PtrVCS2可能通过与其他含有HD的转录因子互作，从而结合到其靶基因上发挥转录抑制/激活功能。因此，作者通过酵母双杂（Y2H）技术筛选了作者克隆到的59个PtrVCS转录因子。结果显示，4个PtrVCSs（PtrVCS4/12/19/94）能够与PtrVCS2互作，其中PtrVCS4为PtrWOX4b蛋白、PtrVCS12为PtrWOX13a蛋白。双分子荧光互补（BiFC）实验验证了PtrVCS2能够与PtrWOX13a、PtrVCS19以及PtrVCS94蛋白互作，发生二聚化（图5a-i）。其中，PtrWOX13a的表达模式与PtrVCS2高度一致，暗示其可能参与了PtrVCS2介导的维管形成层调控。作者进一步通过体外pull down实验验证了PtrWOX13a和PtrVCS2的互作（图5j）。

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图5. PtrVCS2通过与PtrWOX13a二聚化被招募至PtrWOX4a启动子上

接着，作者通过分析PtrVCS2的ChIP-seq数据，鉴定了C(A/C)ATCA(A/C)是出现频率最为靠前的motif之一，并且位于PtrWOX4a启动子上（图5k）。该motif与先前的研究中所鉴定的WOX13能够结合的顺式调控元件序列高度相似，在PtrWOX4a启动子转录起始位点TSS上游2 kb内P2片段上存在两个CAATCAC结合位点，即M1和M2（图5l）。凝胶迁移率阻滞实验（EMSA）表明PtrWOX13a能够直接结合至PtrWOX4a启动子的M1和M2位点（图5m）。作者通过杨树茎木质部原生质体系统（图6a）和基于糖皮质激素受体的诱导基因表达实验（图6b,c），证明了PtrWOX13a对PtrWOX4a的直接转录激活作用。进一步的实验证实了PtrVCS2单独并不能结合PtrWOX4a启动子的M1和M2位点，但是PtrVCS2-PtrWOX13a蛋白聚合物可以（图5n）。最后，作者利用anti-FLAG抗体对OE-PtrVCS2–3×FLAG株系的茎维管形成层进行ChIP-qPCR，发现能够显著富集PtrWOX4a启动子M1和M2位点序列（图5l,o）。同时，利用anti-PtrVCS2抗体对WT茎维管形成层进行ChIP-qPCR，同样能够发现PtrWOX4a启动子M1和M2位点序列的显著富集（图5l,p）。因此，这些研究结果表明PtrVCS2通过与PtrWOX13a的互作，被招募至PtrWOX4a启动子上，从而调控PtrWOX4a基因的表达。

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图6. PtrWOX13a直接调控PtrWOX4a的转录

最后，作者进一步研究了表观修饰对于PtrVCS2-PtrWOX13a-PtrWOX4a这一调控体系的影响。通过比较WT和ptrwox4a ptrwox4b双突以及WT和OE-PtrVCS2株系PtrWOX4a启动子上的组蛋白H3乙酰化水平（H3K9ac、H3K14ac和H3K27ac），结果发现这三个表观标记水平在ptrwox4a ptrwox4b双突植株中PtrWOX4a启动子P2片段上显著升高，但是在显著OE-PtrVCS2降低（图7. a,b）。为了进一步解析PtrVCS2与PtrWOX4a启动子乙酰化修饰之间的关联，作者克隆了杨树中13个组蛋白乙酰化基因和4个组蛋白乙酰转移酶（HAT）基因，通过Y2H筛选发现其中有一个HAT，即PtrGCN5-1能够与PtrVCS2蛋白互作。BiFC（图7d,h,i）和体外pull down实验（图7l）进一步验证了PtrVCS2-PtrGCN5-1之间在核内的特异性蛋白互作关系。同时，PtrWOX13a与PtrGCN5-1同样能够发生互作（图7e,h,j,m）。

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图7. PtrVCS2通过PtrWOX13a-PtrVCS2-PtrGCN5-1-PtrADA2b-3四聚体调控PtrWOX4a启动子上的组蛋白乙酰化水平

GCN5作为HAT的亚基，能够与ADA2二聚化以赋予HAT催化活性。作者在先前的研究中已经证实了PtrGCN5-1-PtrADA2b-3复合体发挥HAT功能。本研究中，作者通过BiFC实验观察到了PtrADA2b-3-PtrWOX13a在细胞核中的二聚体形成（图7f,j,k），但是未曾发现PtrADA2b-3与PtrVCS2之间的蛋白互作（图7g,i,k）。体外pull down实验（图7n）进一步验证了PtrADA2b-3和PtrWOX13a之间的蛋白互作。而在上文中，作者鉴定到了PtrWOX13a-PtrVCS2互作，目前鉴定的5对蛋白两两互作关联（PtrWOX13a-PtrVCS2、PtrVCS2-PtrGCN5-1、PtrWOX13a-PtrGCN5-1、PtrGCN5-1-PtrADA2b-3和PtrADA2b-3-PtrWOX13a）中相互之间存在重叠，暗示可能会组成一个四聚体蛋白复合物，即PtrWOX13a-PtrVCS2-PtrGCN5-1-PtrADA2b-3。进一步的体外pull down实验验证了所有三聚体的存在，即PtrWOX13a-PtrVCS2-PtrGCN5-1（图7o）、PtrWOX13a-PtrGCN5-1-PtrADA2b-3（图7p）、PtrVCS2-PtrGCN5-1-PtrADA2b-3（图7q）和PtrADA2b-3-PtrWOX13a-PtrVCS2（图7r）。这些结果表明，在PtrWOX13a-PtrVCS2-PtrGCN5-1-PtrADA2b-3四聚体中，PtrVCS2可以通过与PtrWOX13a和PtrGCN5互作，从而与PtrWOX13a-PtrGCN5-1-PtrADA2b-3三聚体形成四聚体。

PtrWOX13a-PtrVCS2-PtrGCN5-1-PtrADA2b-3四聚体对PtrWOX4a启动子的结合说明存在一个由组蛋白乙酰化介导的PtrWOX4a反式调控。与此一致，在ptrgcn5-1 ptrgcn5-2双突（图8a）和PtrGCN5-1-RNAi转基因株系的茎维管形成层中，作者发现PtrWOX4a的表达量降低（图7s），同时伴随着PtrWOX4a启动子上组蛋白乙酰化水平的降低（图7t）和形成层细胞层数的减少（图8b,c）。这些结果说明PtrGCN5-1可能通过提升PtrWOX4a启动子上的乙酰化标记H3K9ac、H3K14ac和H3K27ac，从而转录激活PtrWOX4a。

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图8. ptrgcn5-1 ptrgcn5-2双突植株鉴定及其形成层细胞层数的表型

接着，作者通过BiFC实验研究了PtrVCS2对于PtrWOX13a-PtrGCN5-1-PtrADA2b-3蛋白复合体稳定性的影响。作者通过构建融合PtrVCS2和mCherry蛋白，同时与PtrGCN5-1–YFPN和PtrWOX13a–YFPC、PtrADA2b-3–YFPN和PtrWOX13a–YFPC以及PtrADA2b-3–YFPN和PtrGCN5-1–YFPC三对一起共转杨树木质部原生质体，发现PtrVCS2能够显著降低这三对的YFP荧光信号（图9a-f, i）。作为负对照，作者发现PtrVCS2并不能够降低PtrGCN5-1和PtrAREB1-2之间的互作（图9g-i），表明PtrVCS2作用于PtrWOX13a-PtrGCN5-1-PtrADA2b-3蛋白复合体的特异性。如果确实ADA2蛋白，GCN5的AHT催化活性将大打折扣，因此PtrVCS2介导的PtrGCN5-1-PtrADA2b-3蛋白互作紊乱将会导致这一蛋白复合体的组蛋白乙酰化功能。

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图9. PtrVCS2通过扰乱PtrWOX13a-PtrGCN5-1-PtrADA2b-3两两蛋白互作降低其蛋白复合体的HAT活性

为了进一步测试PtrVCS2是否通过抑制PtrWOX13a-PtrGCN5-1-PtrADA2b-3蛋白复合体的HAT活性，从而负调控PtrWOX4a基因的表达，作者纯化了PtrGCN5-1、PtrADA2b-3和PtrVCS2蛋白用于HAT活性实验。作者发现，当PtrGCN5-1蛋白单独存在或是和牛血清蛋白一起是，仅表现出微弱的HAT活性（图9j）。但是，当PtrGCN5-1和PtrADA2b-3一起时，表现出较强的HAT活性，并且不受牛血清蛋白的干扰，但是PtrVCS2能够显著降低其HAT活性（图9j）。综上，这些研究表明杨树中存在一个涉及四聚体蛋白复合物的调控系统，其通过对PtrWOX4a启动子的组蛋白乙酰化水平调控，反式调控杨树木材形成中的维管形成层正常发育（图10）。

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图10. ‘tetramer-PtrWOX4a’调控途径模式示意图及其对形成层细胞增殖的影响

该研究成果由东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室李伟教授研究组完成，李伟教授为通讯作者，姜立泉教授参与指导，在读博士研究生代秀芳为第一作者，该工作得到了国家重点研发计划、中央高校基本科研业务费专项资金项目和黑龙江省“头雁”行动计划的联合资助。



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