背景回顾：The stem cell niche and the size of the root meristem in plants are maintained by intercellular interactions and signalling networks involving a peptide hormone, root meristem growth factor 1 (RGF1). Understanding how RGF1 regulates the development of the root meristem (RM) is essential for understanding stem cell function. 

提出问题：Although five receptors for RGF1 have been identified, the downstream signalling mechanism remains unknown. 

主要发现：Here we report a series of signalling events that follow RGF1 activity.

结果1-RGF1-ROS：We find that the RGF1-receptor pathway controls the distribution of reactive oxygen species (ROS) along the developmental zones of the Arabidopsis root.

结果2-RGF1-RITF1：We identify a previously uncharacterized transcription factor, RGF1-INDUCIBLE TRANSCRIPTION FACTOR 1 (RITF1), that has a central role in mediating RGF1 signalling. 

结果3-RITF1-ROS：Manipulating RITF1 expression leads to the redistribution of ROS along the root developmental zones. 

结果4-ROS-PLT2-RM：Changes in ROS distribution in turn enhance the stability of the PLETHORA2 protein, a master regulator of root stem cells. 

结论-RGF1-RITF1-ROS-PLT2-RM：Our results thus clearly depict a signalling cascade that is initiated by RGF1, linking this peptide to mechanisms that regulate ROS.

 摘 要 

植物中干细胞龛和根分生组织大小是由细胞间互作以及涉及一个多肽激素RGF1的信号转导网络所维持的。对于RGF1如何调控根分生组织的研究对于我们进一步理解干细胞的功能是非常重要的。尽管目前已经鉴定到了5个RGF1的受体，但是其下游的信号转导机制仍然处于未知当中。本文中，作者报道了紧随RGF1作用之后的一系列的信号转导事件。作者发现RGF1-受体通路控制了活性氧物质沿着拟南芥根发育区的分布。作者鉴定到了一个之前并未鉴定的转录因子RITF1，该基因在RGF1信号转导中发挥核心作用。通过调控RITF1基因的表达量，会导致ROS沿着根发育区的再分布。而ROS分布的变化会增强PLT2蛋白的稳定性，该蛋白是根干细胞的主要调控因子。本文的研究结果揭示了一个由RGF1起始的信号转导级联，将该多肽激素与下游ROS再分布调控机制关联在一起。

研究背景

植物的根会遭遇各种不同的环境条件，其能够通过改变生长对这些环境作出相应。跟的生长起始于根分生组织区的细胞分裂。分生区的细胞在分裂后，大多数的细胞会在伸长区增加细胞大小，最后在分化区发育成熟。这些发育区的大小是由植物内部发育信号和外界环境信号共同控制的。ROS是一种植物内部的信号，以建立分生区的大小，其中超氧阴离子主要在分生区积累，而过氧化氢主要在分化区积累，超氧阴离子与过氧化氢之间的平衡调控了从增殖向分化的转变。

RGF1多肽通过内部和外部信号，作用于植物根组织分生区大小的控制。用RGF1处理植物的根能够增加其分生区的大小，同时拟南芥rgf1/2/3三突植株的根具有较小的分生区。RGF1受体的五突rgfr植株在根分生组织中缺失了大部分的细胞，并且对于RGF1处理表现出不敏感性。RGF1信号转导控制了PLT1/2蛋白的稳定性，而这两个蛋白是根中干细胞维持的必要因子。但是，RGF1如何调控根分生区的大小和PLT1/2蛋白的稳定性还不清楚。

研究结果1-RGF1通路下游ROS信号

作者用RGF1多肽处理拟南芥的根组织，并通过一个特异性标记分生区的荧光标记HPY2-GFP发现处理后的拟南芥根组织膨大与更大的分生区相关联（Extended Fig. 1a-c），说明RGF1主要影响了根组织分生区的基因表达。因此，为了鉴定RGF1下游的靶基因，作者分离出了RGF1处理1小时后的根分生区（Extended Fig. 1d）。考虑到此时HPY2-GFP的表达和分生区的大小还未发生明显的变化，作者排除了分生区的增大是由RNA水平的改变所导致的。通过RNA-seq，作者鉴定到了RGF1处理和Mock之间存在583个差异表达的基因，基因功能富集发现这些基因显著富集于“谷胱甘肽转移酶活性”和“氧化还原酶活性”条目（Extended Fig. 2），说明RGF1可能通过ROS这个中间载体进行下游的信号传导。

为了研究RGF1和ROS信号转导之间的关系，作者分析了RGF1处理后，根中超氧阴离子和过氧化氢的分布。RGF1处理后24小时，过氧化氢特异性探针H₂O2-BES-Ac在分生区和伸长区的荧光信号更弱（Fig. 1a，c）。而RGF1处理后24小时，通过硝基四氮唑蓝（NBT）染色发现在分生区的信号更加广泛（Fig. 1b，d）。在RGF1受体突变体rgfr1/2/3中，RGF1处理后分生区没什么改变（Fig. 1e），并且过氧化氢和超氧阴离子在RGF1处理和Mock之间没有明显差异（Fig. 1e-h）。

研究结果2-RGF1通路下游因子RITF1

为了鉴定RGF1和ROS信号转导通路的下游因子，作者比较分析了本文中的RGF1转录组数据和已报道的根发育区特异性转录组数据。结果在分生区特异性表达和受RGF1诱导表达的基因中，作者鉴定到了PLAT2基因，该基因在RGF1处理后1小时表达量增加了两倍左右（Fig. 2a）。作者将其重新命名为RGF1诱导转录因子RITF1，发现其主要在分生区表达（Fig. 2b）。RT-PCR实验显示，野生型拟南芥在RGF1处理后1个小时，RITF1基因的表达量提升了约两倍，在之后的6小时和24小时保持不变（Fig. 2c）。相反，在rgfr1/2/3突变体的根中，RGF1处理并不会影响RITF1基因的表达量（Fig. 2c）。作者进一步利用RITF1基因的启动子驱动GFP蛋白构建了报告株系pRITF1-GFP，结果显示与转录组数据吻合，在RGF1处理后在根中的荧光信号增强（Fig. 2b，d，e）。相反，pRITF1-GFP的表达在rgfr1/2/3突变体中尤其的低，且在RGF1处理后没有发生改变（Fig. 2d，e）。这些数据说明RITF1基因的表达受到RGF1通路的调控。

研究结果3-RITF1作用于RGF1下游，调控ROS信号

为了进一步研究RITF1基因的功能，作者利用雌二醇诱导启动子系统构建了RITF1诱导过表达。在β-雌二醇处理后24小时，根分生区增大，并且细胞数量增多（Fig. 2f，i），与RGF1处理的根的表型类似（Fig. 1a）。作者还发现过氧化氢的水平在β-雌二醇处理后，在根的分生区、伸长区和分化区均呈现出下降趋势（Fig. 2g，j），而分生区超氧阴离子的表达呈现出扩张的现象（Fig. 2h，k），同时伸长区和分化区出现了超氧阴离子的信号（Fig. 2h）。ROS信号的改变和分生组织的扩大说明RITF1基因作用于RGF1通路的下游，调控ROS信号转导和根分生组织大小。作者还观察到RITF1基因的诱导要比RGF1处理的响应更早。β-雌二醇处理后4小时， H2O2-BES-Ac信号就发生了衰减（Extended Fig. 3a，b），而相同时间段在未诱导的株系或是RGF1处理的野生型植株中，还检测不到H2O2-BES-Ac信号的减弱（Extended Fig. 3a，b）。在这些株系中，ROS信号的改变在RGF1处理后6小时，才第一次出现（Extended Figs. 4i，j，o，p和5b，c）。

如果RITF1基因作用于RGF1受体通路的下游，那在rgfr1/2/3突变体中过表达RITF1基因应该能够拯救其根分生组织的缺陷，增加分生组织的大小。为了测试这个推测，作者分别在野生型和rgfr1/2/3突变体中诱导过表达了RITF1基因，发现这两个株系均表现出了超氧阴离子信号增强、根分生组织增加的表型（Fig. 3a-d）。接着，作者通过CRISPR-Cas9技术创制了一个ritf1-1突变体，在编码区前段发生了移码突变，使其不能够产生有功能的RIFT1蛋白。另外，作者还有一个ritf1-2突变体，这个突变体RITF1基因的内含子中有一个T-DNA插入，虽然降低了RITF1基因的表达，但仍然能够保证低水平的功能性RIFT1蛋白。相比于野生型和ritf1-2突变体，ritf1-1突变体具有更小的分生组织和更低的根生长速率（Extended Fig. 6a，b），并且对于RGF1处理更加不敏感（Extended Fig. 6b，c）。此外，相比于野生型和ritf1-2突变体，ritf1-1突变体在RGF1处理后根中超氧阴离子的诱导水平更低（Fig. 3e，f）。综上，这些结果说明了RITF1基因是RGF1信号转导通路中调控ROS信号和根分生组织的主要调控因子。

研究结果4-ROS信号调控PLT2蛋白稳定性

为了研究PLT2的翻译后调控，作者比较了转录（pPLT2-CFP）和翻译（gPLT2-YFP）水平的荧光融合蛋白株系。在RGF1处理后24小时，相比于Mock，RGF1处理后的根具有更大的分生区，作者发现gPLT2-YFP具有更加广泛的信号分布（Extended Fig. 7b），而pPLT2-CFP的信号在Mock和RGF1处理之间没有显著差异（Extended Fig. 7a）。RGF1处理后，gPLT2-YFP信号在更大的分生区分布广泛，并且呈现出逐渐较弱的趋势（Extended Fig. 7c）。这些结果说明RGF1介导了PLT2的翻译后调控。

PLT2是AP2/ERF转录因子家族的成员之一，在先前的研究中显示其受到氧化翻译后修饰的调节。为了确定氧化条件能否增加PLT2蛋白的稳定性，作者利用gPLT2-YFP株系测试了RGF1处理和过氧化氢清除剂碘化钾（KI）处理后的响应。作者发现相比于仅用RGF1处理，同时用RGF1和KI处理的植株中的gPLT2-YFP信号分布更加广泛，且分生组织更大（Fig. 4a-c）。相反，在RGF1处理条件下增加过氧化氢的水平会抑制 gPLT2-YFP的广泛分布，同时减少分生组织大小的增量（Extended Fig. 8a-e）。为了降低超氧阴离子的水平，作者利用500nM的NADPH 氧化酶抑制剂DPI处理，导致PLT2蛋白稳定性的轻微抑制和分生组织大小的轻微减小（Fig. 4d-f），对根分生组织发育几乎没有影响。但是，与仅用RGF1处理相比，同时用RGF1和DPI处理，能够显著降低PLT2蛋白的稳定性和分生组织的大小（Fig. 4d-f）。最后，作者测量了RGF1处理后4-10小时时间段上gPLT2-YFP、超氧阴离子和过氧化氢的水平。gPLT2-YFP更广泛的分布、分生区末端超氧阴离子水平的增加和过氧化氢信号的降低出现在RGF1处理6小时后。（Extended Fig. 4a-d，i，j，o，p和5a-c）。在处理后8小时和10小时，扩张的gPLT2-YFP表达和超氧阴离子信号与衰弱的过氧化氢信号相关（Extended Fig. 4e-h，k-n，q-t和5a-c）。综上，这些结果表明ROS通过调节超氧阴离子和过氧化氢水平，调控PLT2蛋白的稳定性。

研究结果5-RGF1-RITF1-ROS-PLT2-RM

为了进一步测试RITF1基因诱导产生的ROS信号增强了PLT2蛋白的稳定性，作者在plt2突变体中过表达了RITF1基因。过表达株系中，超氧阴离子水平增加（Extended Fig. 9a，b），但是并不能诱导根分生组织的增大（Extended Fig. 9c，d）。此外，与野生型相比，RGF1处理仅导致plt2突变体根分生组织的微弱改变（Extended Fig. 10a，b）。但是，作者并未观测到增强的超氧阴离子信号（Extended Fig. 10c，d）。这些结果说明RITF1基因调控的ROS信号增强了PLT2蛋白的稳定性。 总的来说，作者在本文中鉴定到了一个转录因子RITF1，其在植物根的分生区受到RGF1的诱导表达。而RITF1能够控制ROS水平，从而调控PLT2蛋白的稳定性和分生组织大小。综上，本文的研究结果揭示了植物多肽激素RGF1通过ROS水平，控制根中增殖向分化的转变，从而调控根的生长。