背景回顾：Liriodendron tulipifera, also known as tuliptree, is a popular ornamental horticultural plant with extraordinary tulip-shaped flowers characterized by an orange band near their base. 

提出问题：The mechanisms underlying petal band-specific pigmentation during L. tulipifera flower development are unclear. 

主要发现：Here, we combined nontargeted and targeted metabolomics and transcriptomics to identify a pathway cascade leading to carotenoid biosynthesis that is specifically activated in the petal band. The comparative analysis of carotenoid metabolites between L. tulipifera and Liriodendron hybrids indicates that γ-carotene, a rare carotene in plants, is the most likely orange pigment responsible for the coloration of the petal band. Phenotypic and transcriptomic analyses of developing petals reveal that the band area is first predefined by the loss of green color. Later, the band is maintained by locally activating and repressing carotenoid and chlorophyll biosynthesis genes, respectively. Two rate-limiting genes of carotene biosynthesis, carotenoid isomerase (CRTISO) and epsilon lycopene cyclase (ε-LCY), encode the core enzymes responsible for petal band-specific orange pigmentation in L. tulipifera. In particular, a putative additional ε-LCY copy specific to L. tulipifera may contribute to the distinct petal coloration pattern, compared with L. chinense. 

结果总结：Taken together, our work provides a first glimpse of the metabolome and transcriptome dynamics in tuliptree flower coloration and provides a valuable resource for flower breeding or metabolic engineering as well as for understanding flower evolution in an early woody angiosperm.

花瓣颜色是植物吸引授粉者保证生殖成功的一个主要花性状。花瓣颜色的表型改变能够引起花-授粉者之间关系的改变，从而驱动生殖隔离，甚至是新物种的形成。花颜色的多样性主要是三种植物色素的作用，分别是类黄酮（flavonoids）、类胡萝卜素（carotenoids）以及甜菜素（betalains）。前两个色素广泛分布于植物界，而甜菜素仅存在于石竹目（Caryophyllale）。在这些植物色素中，类黄酮是无可争议研究的最为深入的植物次生代谢物，并且其颜色分布范围最广，有覆盖了橙色到蓝色的花青素（anthocyanins），也有呈淡黄色的查尔酮类（chalcones）、橙酮类（aurones）以及花黄素类（anthoxanthins）。尤其是，在胞质中合成，并定位于液泡的水溶性花青素是主要的类黄酮色素，作用于许多植物花的着色。花青素的生物合成以及调控的研究比较深入，具有一个高度保守的“MBW”调控复合物，由R2R3-MYB、bHLH和WDR蛋白组合而成，在花青素的调控中占据核心作用。尽管由质体合成并定位于质体的脂溶性C40四萜化合物类胡萝卜素的生物合成通路已经十分明了，但是其生物合成的转录调控机制还不是很清楚，尤其是花中的转录调控机制。类胡萝卜素不仅对于植物来说是不可或缺的，作用于色素沉着、光合作用中的光保护以及植物激素脱落酸和独脚金内酯的合成；同时，对于人类的营养和健康也是至关重要的。目前，我们亟需鉴定类胡萝卜素生物合成和积累背后潜在的分子调控机制，这将有助于观赏植物以色彩性状为目标的育种，同时也有利于农艺作物的营养质量改良。

北美鹅掌楸（学名：Liriodendron tulipifera）属于木兰科鹅掌楸亚科鹅掌楸属植物物种，天然分布于北美东部地区。鹅掌楸属中仅包含两个植物物种，另一个就是天然分布于东亚的鹅掌楸（学名：Liriodendron chinense），这两个物种共同构成了典型的东亚-东部北美洲际间断分布．这两个比较近缘的林木树种，其在形态上明显区分于木兰科的其他物种，尽管二者之间已分化了10-16个百万年，但整体的形体特征还是比较近似。北美鹅掌楸与鹅掌楸之间存在少数的几处比较明显的表型分化，其中一个就是花色。鹅掌楸的花瓣整体呈绿色，有黄色的叶脉贯穿其中，而北美鹅掌楸的花瓣在基部位置有一条明亮的橙黄色色带。此外，这两个近缘种之间的种间杂交是可行的，并且杂交鹅掌楸的花大而艳丽，花的大部分区域都被橙色色素所覆盖，并且杂交鹅掌楸在生物量上存在十分显著的杂种优势。北美鹅掌楸除了具有木材和花蜜生产方面的商业价值，其也被广泛用作公园或庭院种植的观赏园艺树种。尽管形似郁金香的花朵是北美鹅掌楸一个重要的观赏性状，但其花瓣基部色带着色的发育、调控以及生化基础仍不清楚。本文中，我们结合了转录组和代谢组鉴定了作用于鹅掌楸属植物花着色的关键色素，并揭示了一个可能的转录调控机制。

根据前期的观察，北美鹅掌楸的花瓣存在特异性的着色模式，即在花瓣基部存在一条橙黄色的色带，为了研究潜在的代谢基础（花青素？类胡萝卜素？）和基因转录调控（色素合成基因表达及时空表达调控），连续选取了6个时期的正在发育中的花苞或花（Fig. S1），解剖结果及连续发育时期之间色带区域的颜色比较发现，其中有两对连续发育时期的颜色比较接近（Fig. S3），因此选取了四个发育时期，重新编号S1P（stage 1: petal）、S2P、S3P和S4P。另外，由于萼片在整个发育期间均保持绿色，选取了S3P对应的萼片，编号S3S（stage 1: sepal）；由于花瓣只在近基部位置存在色带，因此将花瓣解离成了两部分，有色带的下部S3PL（stage 3: petal - lower side）和没有色带的上部S3PU（stage 3: petal - upper side）。基于一组时间序列和两组比较组，通过非靶向代谢组和转录组鉴定可能的代谢基础和基因调控网络。

Supplementary Figure 1. Sample and developmental stage selection.

Supplementary Figure 3. Color changes during the petal development.

非靶向代谢组没能鉴定到确定的代谢物，但是给了一些暗示。时间序列代谢组中显示，在含量随发育时间降低的cluster中富集到了“phenylpropanoid biosynthesis”、“flavonoid biosynthesis”和“flavone and flavonol biosynthesis”三个通路，而在含量随发育时间增加的cluster中富集到了“glycolysis/gluconeogenesis”通路。由于phenylalanine是合成黄酮类化合物花青素的前体，而糖酵解/糖异生通路的产物D-甘油醛3-磷酸用于萜类骨架的生物合成，因此推测萜类化合物类胡萝卜素可能是作用于北美鹅掌楸花瓣着色的色素基础。

时间序列转录组分析获得了10个不同的表达模式聚类。其中，在S1P表达量最高，而后三个时期表达量显著降低的Cluster中，富集到了“photosystem I”、“photosystemI reaction center”和“photosystem II oxygen evolving complex”等光合相关的GO条目（Fig. 2）。考虑到北美鹅掌楸花瓣第一个时期还未开始积累橙黄色色素，花瓣仍然保持绿色，而后从S2P开始花瓣基础色带处开始积累橙黄色色素，与富集结果一致。另外，前三个时期表达量很低，S4P具有较高表达量的Cluster中富集到了花粉相关条目，比如“recognition of pollen”和“pectinesterase activity”，以及衰老相关条目“peroxidase activity”。考虑到S4P时期的花进入了完全开放，而后2-3天凋落，此时的花已经完成授粉，进入了衰老进程。因此，与花瓣着色相关的基因在该时间序列中应该具有先上调、后下调的表达模式，即在S2P、S3P两个时期表达量较高，而在S1P和S4P时期表达量较低，有两个Clusters符合这种表达模式，但是这两个clusters都没有富集到与植物色素合成相关的条目。

Fig. 2 Transcript abundance of differentially expressed genes (DEGs) during Liriodendron petal development.

因此，下一步是综合这些转录组分析，进一步缩小候选靶基因。但是时间序列中，根据K-means方法获得的表达模式聚类并不能将所有具有目的表达模式的基因聚类到同一个cluster中。因为，这里需要鉴定的基因属于发育中期表达基因，我们借鉴了Levin等人于2016在Nature上发表关于发育中期模块的方法（DOI: 10.1038/nature16994），鉴定了S1P-S2P-S3P-S4P时间序列中中期特异性高表达的基因（Fig. 4a-d）。然后，再与S3P-S3S以及S3PL-S3PU两组比较组中分别在S3P和S3PL中高表达的基因集取交集，共获得了79个转录本，KEGG富集分析显示这79个转录本富集到了一个“carotenoid biosynthesis”通路，并且其余富集到的通路都与carotenoid biosynthesis有着千丝万缕的关系（Fig. 4e）。

进一步的分析发现，这些富集到了的通路构成了一个通路级联，并且该通路级联上的大部分基因在北美鹅掌楸花发育中期在花瓣下部色带处特异性被激活（Fig. 5）。

根据非靶向代谢组和转录组的分析显示，北美鹅掌楸花瓣着色的色素最有可能是类胡萝卜素。于是，通过靶向代谢组，我们定量了类胡萝卜素生物合成通路中的代谢物，以确定具体的哪一个类胡萝卜素是着色的关键色素。通过北美鹅掌球花瓣的类胡萝卜素靶向代谢组分析显示，γ-carotene和ε-carotene是两个最有可能的色素（Fig. S14）。另外，杂交鹅掌楸的花瓣会显示出整个花瓣被橙黄色色素覆盖的特征。因此，我们取了两株杂交鹅掌楸的花瓣，定量了胡萝卜素的含量，结果显示γ-carotene的含量异常的高（Fig. S15）。这些结果显示γ-carotene可能是北美鹅掌楸花瓣基部色带形成的代谢物质基础。

为了进一步鉴定类胡萝卜素生物合成通路中作用于北美鹅掌楸花色着色的关键酶，我们进一步将所有的基因map到了“carotenoid biosynthesis”通路上（Fig. S16）。结果显示，直到番茄红素（lycopene）之前，每个反应进程的作用酶都至少有一个转录本在不同时期或组织之间都存在较高的表达。而后，番茄红素会进一步被β-LCY基因催化形成γ-carotene，而γ-carotene进一步在β-LCY基因的催化下形成β-carotene。这也是导致γ-carotene在自然界植物中比较稀少的原因。这里，β-LCY基因在不同时期或组织之间的表达没有明显变化，这与β-carotene的含量波动一致，但是明显不能解释γ-carotene的动态波动。另一边，番茄红素也会进一步被ε-LCY基因催化形成δ-carotene，而δ-carotene进一步在ε-LCY基因的催化下形成ε-carotene，或是δ-carotene进一步在β-LCY基因的催化下形成α-carotene。其中，ε-LCY基因具有花瓣发育中期以及花瓣和花瓣下部特异性高表达的表达模式，与ε-carotene的含量波动具有一致性。

为了进一步解释γ-carotene的含量波动，我们鉴定了鹅掌楸基因组与北美鹅掌楸基因组（内部数据）中的LCY基因情况。结果发现，无论是β-LCY基因，还是ε-LCY基因，鹅掌楸基因组中均只有一个拷贝，而北美鹅掌楸基因组中均有三个拷贝。基因表达分析显示，北美鹅掌楸中的三个β-LCY基因，只有一个拷贝有表达，但是表达没有波动。另外，三个ε-LCY基因拷贝北美鹅掌楸花瓣中的表达具有发育中期及花瓣和花瓣下部特异性高表达的表达模式。而且，对于两颗杂交鹅掌楸的转录组从头组装获得转录本中，我们鉴定了所有的LCY基因转录本，发现只有与北美鹅掌楸聚在一支的一个转录本具有非常高的表达量，而与鹅掌楸聚在一支的转录本没有很高的表达量。这些结果显示，北美鹅掌楸的ε-LCY基因可能是北美鹅掌楸和杂交鹅掌楸花色着色的关键酶。

1. 北美鹅掌楸花瓣近基部的色带在着色之前就已经有了明显的区域界限，色带区域的“预定义”是通过叶绿素生物合成的抑制所决定的，导致该区域表现出苍绿色。而后，色带区域开始着色，类胡萝卜素生物合成被特异性地在色带处激活，同时叶绿素的生物合成被持续抑制。

2. 北美鹅掌楸的色带在很早就定义完成，并且区域大小并不随花瓣的伸长而扩张。所以在北美鹅掌楸花发育过程中，色带处存在某种机制抑制了该区域的扩张。

3. 北美鹅掌楸中ε-LCY基因可能发生了新功能化，可以将番茄红素或者其他形式的胡萝卜素转化形成γ-carotene。

4. 鹅掌楸花瓣通体呈绿色，带有黄色的叶脉贯穿其中。北美鹅掌楸花瓣基部具有橙黄色的条带。杂交鹅掌楸花瓣整个花瓣被橙黄色的色素覆盖。推测，杂交鹅掌楸中，来自北美鹅掌楸的ε-LCY基因作用于γ-carotene的合成，而来自于鹅掌楸的某个基因可以介导北美鹅掌楸ε-LCY基因在整个花瓣区域的表达。该基因对应在北美鹅掌楸中的表达模式局限于色带区域，而在鹅掌楸中则在整个花瓣的叶脉中均有表达。（这是假设之一，还有其他可能的假设，比如说在北美鹅掌楸中，上半部分的花瓣中存在某个橙黄色色素合成抑制因子。而到了杂交鹅掌楸中，该基因功能削弱，不能发挥抑制作用，导致橙黄色色素覆盖杂交鹅掌楸的整个花瓣）