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bioRxiv：雌雄异株林木美洲黑杨的性别决定基因鉴定

已有 5034 次阅读 2020-4-23 08:04 |个人分类:提纲挈领|系统分类:论文交流

Two antagonistic effect genes mediate separation of sexes in a fully dioecious plant

First author: Liangjiao Xue; Affiliations: Nanjing Forestry University (南京林业大学): Nanjing, China

Corresponding author: Tongming Yin

Plant sex determining systems and sex chromosomes are often evolutionarily young. Here, we present the early stage of sex chromosome in a fully dioecious plant, P. deltoides, by determining separate sequences of the physically small X- and Y-linked regions. Intriguingly, two Y genes are absent from the X counterpart. One gene represses female structures by producing siRNAs that block expression of a gene necessary for development of female structures, via RNA-directed DNA methylation and siRNA-guided mRNA cleavage. The other gene generates long non-coding RNA transcripts that, in males, soak up miRNAs that specifically inhibit androecium development. Transformation experiments in Arabidopsis thaliana show that the two genes affect gynoecium and androecium development independently and antagonistically. Sex determination in the poplar therefore has the properties proposed for the first steps in the evolution of dioecy in flowering plants, with two genes whose joint effects favor close linkage, as is observed in poplar.

植物的性别决定系统和性染色体相对来说在演化史比较“年轻”。本文中，作者发现一个完全雌雄异株的林木美洲黑杨（Populus deltoides）处于性染色体形成的早期阶段，其中雌株和雄株的性别在遗传上分别由两小段与X或Y物理连锁的序列所决定。有趣的是，有两个Y基因在对应的X染色体上丢失了。其中一个基因产生的siRNA通过RNA指导的DNA甲基化和siRNA引导的mRNA剪切来阻断一个对于雌性结构发育至关重要的基因的表达，从而达到抑制雌性结构发育的作用。而另外一个基因能够产生长链非编码RNA（lncRNA）转录本，这些lncRNA转录本在雄性中会消耗一些特异作用于雄蕊发育抑制的miRNAs。拟南芥中的遗传转化试验显示这两个基因能够分布独立并且拮抗地影响雌蕊和雄蕊的发育。因此，杨树中的性别决定系统为开花植物雌雄异株早期演化的研究提供了一个平台，其中两个具有联合效应的性别决定基因比较偏向于紧密连锁。

Backgroud

大部分被子植物的花属于两性花，即所谓的两性同体（hermaphroditism），只有大约10%的被子植物演化出了单性花，同一株上同时出现雌、雄两种单性花即为雌雄同株（monoecism），而同一株上只有雌花或雄花即为雌雄异株（dioecism）。（p.s. 自然界中还存在比较稀有的状态，即雄全异株（androdioecy），这一类群比较稀少，其中桂花（Osmanthus fragrans）是最为人熟悉的具有雄全异株繁育系统的植物）。

雌雄异株（dioecism）在被子植物不同支系中独立演化出多次，近年来在芦笋（asparagus；雌性抑制基因SOFF，雄性促进基因aspTDF1）和猕猴桃（kiwifruit；雌性抑制基因SyGI，雄性促进基因FrBy）中的研究显示，该繁育系统由两性同体演化而来，其中两个Y染色体上完全连锁的基因相互独立、却又互相拮抗地作用于雌性和雄性发育。

除了双基因系统之外，单基因控制的雌雄异株也存在。在玉米（maize）和甜瓜（melon）中，人为设计出了该系统；而在柿子（persimmon）中则是天然演化出了单基因控制系统，柿子Y染色体上的假基因OGI通过抑制常染色体上的旁系同源基因MeGI来作用于雄花的特化。

1. Mapping the sex-determining locus and reconstructing X and Y haplotypes

Fig. 1. Reconstructed haplotypes in the SLR of P. deltoides chromosome XIX. (A) Genetic map and physical positions of the SLR (red bar) and the telomere. (B) SLR-X and SLR-Y haplotypes reconstructed from genome sequences of 690 our sequenced male. (C) The Y-specific 695 region rebuilt from 13 PCR amplified fragments. (D) Agarose gel electrophoresis profile for fragment F_657 in females and males.

作者对一株雌性美洲黑杨以及其雄性子代进行了测序、组装，雌株基因组大小431Mb，contig N50长1.4Mb；雄性基因组大小414Mb，contig N50长2.8Mb。利用SSR标记将性别决定位点定位到了19号染色体上端粒与N362标记之间的299kb基因组区域上，作者将其定义为性别连锁区域（sex-linked region），简写SLR（Fig 1A）。另外，由于雄株是雌株的直系后代，因此雄株XY染色体的X是来自于雌株。作者进一步通过SNP分型，分别构建了雄株的X和Y单倍体（Fig 1B）。通过比较X和Y单倍型的SLR区域，作者发现Y染色体上存在一长一短两个半合子区段，并通过PCR验证了雄性中的半合子区段（Fig 1C、D）。

2. Identification of sex determining genes

Fig. 2. Manhattan plots of GWAS analysis on sex of P. deltoides. (A-B) Results when the female genome was used as the reference in our GWAS analyses (A shows the SNP analysis B shows the analysis of coverage). (C-D) Results using SLR-Y as the reference genome in GWAS analyses using either SNPs (C) or coverage (D). Genes completely associated with sex are listed in the diagram of chromosome XIX below parts C and D. R1-R5 indicate regions containing variants above red lines.

为了进一步的鉴定性别决定基因，作者基于49棵雌株和46棵雄株的SNP数据进行了GWAS分析。利用雌株基因组作为reference，作者鉴定到了435个SNP存在雌株纯合、雄株杂合的基因型（作者将其叫做SEMS），其中315个SEMSs存在于三个SLR基因中，分别是TCP、CLC和MET1（Fig 2A）。剩余的SEMSs中，78个位于一个叫做FERR基因位点上，该位点虽然同在19号染色体上，但是属于拟常染色体（pseudo-autosomal）。至于剩下的那些SEMSs均分布于常染色体上。由于使用的是雌性基因组作为参考序列，可能会将来自Y连锁区域的read比对到X染色体的其它同源区域，从而造成假阳性的SEMS。通过进一步利用SLR-Y作为参考基因组，果真发现所有常染色体上SEMS全部消除不见（Fig 2C）。另外，采用read coverage，mapping基因组上只在一个性别中存在，而在另一个性别中确实的基因组区域，结果发现以SLR-X作为reference没有鉴定到任何结果，而以SLR-Y作为reference则鉴定到了与之前一致的半合子区段区域（Fig 2D）。而在其中长的半合子区段含有两个基因，分别是FERR-R和MmS。

3. Expression of candidate sex determining genes

Fig. 3C. Gene expression profiles during the development of flower buds.

为了进一步确认上文所鉴定到的候选基因，作者定量了这些基因在杨树雌花和雄花发育过程中的表达水平。结果发现，TCP、CLC和MET1基因在雌、雄花发育过程中均有表达，且没有明显的偏向性。而FERR只在雌花中表达，FERR-R和MmS基因只在雄花中表达。由于FERR基因处于拟常染色体区域，而则处于Y染色体的半合子区域，因此作者推测这两个基因可能作用于杨树的性别决定 (Fig 3)。

4. FERR-R is a femaleness suppressor that generates siRNAs suppressing FERR function

Fig. 4. Origin of FERR-R and its function in repressing FERR. (A) Sequence homology analysis for FERR-R. (B) Abundance of FERR-R transcripts and the FERR-R generated siRNAs, and the differential methylation of FERR in the two sexes. (C) Transient expression experiment in poplar protoplasts. siFERR is siRNA generated by FERR-R. FERR’ is the siRNA resistant version of FERR.

序列比对显示FERR-R基因与FERR基因序列相似性较高，在启动子和外显子的大部分区域存在序列同源（Fig 4A）。链特异性lncRNA和small RNA测序数据显示，FERR-R基因转录成一条长的转录本，然后会形成小的干扰RNAs，即siRNAs（Fig 4B）。并且由FERR-R基因产生的siRNA可以指导FERR基因启动子、5’-UTR以及第一个外显子和内含子上的DNA甲基化（Fig 4B）。亚硫酸氢盐测序显示FERR基因位点这些区域上的DNA甲基化只是特异性的在雄株中存在（Fig 4B）。此外，FERR-R基因产生的siRNA还能够靶向FERR基因的三个外显子，表明FERR-R基因可能还会参与siRNA引导的FERR基因转录本剪切，作者进一步通过瞬间表达试验验证了这一点（Fig 4C）。结合上文对于FERR基因在雌雄花中的表达分析，以及在拟南芥中的过表达试验（Fig 5A），作者推测FERR基因作用于促进雌性器官发育，而雄株中特有的FERR-R基因则作用于FERR基因功能的抑制。

Fig. 5. Phenotypes of transgenic Arabidopsis. (A) Phenotypes of FERR overexpression lines. The red arrows point to the carpel-like sepals.

5. The MmS gene locus reduces miRNA levels and promotes maleness

Fig. 6A. Gene structure and transcription of MmS, and the miRNA binding sites in the MmS transcript. The yellow boxes indicate predicted MmS exons. The middle track visualizes the abundance of lncRNA. The miRNAs binding sites are numbered in the bottom track, and binding site 9 is zoomed in.

生信分析显示MmS的转录本能够结合多个miRNA（Fig 6A）。qRT显示MmS基因在雄花不同发育时期持续表达（Fig 3C）。作者推测MmS基因通过结合多个miRNAs，从而使得雄株中的miRNAs相比于雌株中的更少，也阻断了雄株中这些miRNA对于其靶基因的抑制，而这些靶基因可能作用于促进雄性器官发育。杨树MmS基因在拟南芥中的过表达试验显示其能够增加拟南芥的雄蕊，但不影响雌蕊的发育（Fig 5B）。