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Science：单个转录因子IPA1促进水稻的产量和免疫

已有 12193 次阅读 2018-9-10 09:21 |个人分类:一周精读|系统分类:论文交流

A single transcription factor promotes both yield and immunity in rice

First author: Jing Wang; Affiliations: Sichuan Agricultural University (四川农业大学): Chengdu, China

Corresponding author: Xuewei Chen (陈学伟)

Abstract

Plant immunity often penalizes (不利于) growth and yield. The transcription factor Ideal Plant Architecture 1 (IPA1) reduces unproductive tillers (分蘖) and increases grains per panicle, which results in improved rice yield. Here we report that higher IPA1 levels enhance immunity. Mechanistically, phosphorylation of IPA1 at amino acid Ser163 within its DNA binding domain occurs in response to infection by the fungus Magnaporthe oryzae (稻瘟病菌) and alters the DNA binding specificity of IPA1. Phosphorylated IPA1 binds to the promoter of the pathogen defense gene WRKY45 and activates its expression, leading to enhanced disease resistance. IPA1 returns to a nonphosphorylated state within 48 hours after infection, resuming support of the growth needed for high yield. Thus, IPA1 promotes both yield and disease resistance by sustaining a balance between growth and immunity.

植物免疫通常不利于植物的生长和产量。转录因子IPA1能够减少水稻非生产性的分蘖，并增加每个稻穗的籽粒，从而提升了水稻的产量。本文报道了高水平的IPA1增加了水稻的免疫力。水稻响应于稻瘟病菌侵染，IPA1基因的DNA结合结构域区163位丝氨酸发生磷酸化，改变了IPA1的DNA结合特异性。磷酸化后的IPA1结合到病原菌抗性基因WRKY45的启动子区，激活该基因的表达，进而增强水稻的疾病抗性。在侵染后的48小时，IPA1恢复到未被磷酸化的状态，继续作用于水稻的正常生长，保证水稻产量。因此，IPA1通过维持水稻生长和免疫之间的平衡同时促进了水稻的产量和疾病抗性。

Introduction

植物的免疫系统激活通常会延缓植物的生长，从而产量与抗病性不可兼得。若植物不激活免疫系统，虽然生长十分迅速，但也容易被各种疾病所侵染、危害。有着许许多多的蛋白作用于植物生长和免疫之间的平衡。比如说，拟南芥BZR1和HBI1基因能够促进植株生长，但同时也抑制了植株的免疫。相反，转录因子TBF1和WRKY45能够增强植物免疫，但同时也抑制了植物的生长。育种实践已经选择到了同时具备高产和疾病抗性强的作物品种。已知有多个基因作用于维持植物生长和免疫之间的平衡，比如一个转录因子Bsr-d1基因的天然等位基因、一个化学诱导的编码RNA结合蛋白的Bsr-k1等位基因、一对核苷酸结合寡聚化结构域样受体NLR（PigmR和PigmS）、一个包含NPR1或snc1在内的人工、病原诱导的基因盒。然而，目前为止还未有单个蛋白同时正向调控植株产量和抗性的报道。

Results

1. 水稻理想株型基因IPA1同时可作用于稻瘟病菌抗性

水稻供养了大约世界一半的人口，水稻产量的提升将有助于满足日益增长的人口所带来的食物供给需求。籽粒产量取决于每个植株上生产性分蘖的数量、每个稻穗中的籽粒数量及籽粒的重量。水稻理想植株基因IPA1作为一个转录因子，编码一个SQUAMOSA启动子结合蛋白OsSPL14，能够激活DEP1等产量相关基因，减少水稻非生产性的分蘖，增加每个稻穗的籽粒，进而提升水稻产量。ipa1-1D等位基因在miR156和miR529靶位点存在一个突变，从而解除了miR156和miR529的抑制效应，增加了IPA1的RNA和蛋白水平。尽管研究显示ipa1-1D植株在不同大田条件下增产10%，但其在病菌侵染条件下能否保持产量的提升还不清楚。作者测试了能够导致水稻稻瘟病害的Magnaporthe oryzae菌侵染条件下ipa1-1D植株的产量。作者基于R320和R441两个水稻品系开发的同基因型水稻系布置了连续3年的田间试验，结果显示ipa1-1D植株R320ipa1-1D和R441ipa1-1D在没有病原菌侵染的正常条件下相比于对照产量提升10.1~13.3%（Fig. 1A、B），而在有水稻稻瘟病菌侵染条件下相比于对照产量提升30.7~48.2%（Fig. 1C、D）。在正常条件下10~13%的产量增长与前人的报道一致。ipa1-1D介导的产量提升在病原菌胁迫下表现会更好，说明IPA1可能提升了水稻对于稻瘟病菌的抗性。为了验证这个假设，作者构建了IPA1过表达（IPA1-GFP）和RNAi干扰株系。结果显示无论在离体叶片，还是在喷雾接种的叶片中，IPA1过表达株系的抗性增强，而RNAi干扰株系更易被多个稻瘟病菌的分离菌侵染（Fig. 1E-G）。

2. 水稻稻瘟病侵染时IPA1基因发生磷酸化作用

因为稻瘟病菌侵染条件下水稻植株中IPA1的RNA和蛋白水平并未发生改变（Fig. 2A），作者研究了稻瘟病菌侵染条件下ipa1-1D植株中IPA1蛋白是否被磷酸化。作者通过含Phos-tag的凝胶及IPA1多克隆抗体筛选将磷酸化的IPA1从非磷酸化的IPA1中分离出来。磷酸化IPA1蛋白在侵染3小时后开始积累，在6-12小时后达到最高峰，而在48个小时后恢复到正常水平（Fig. 2B）。已知在不同的SPL蛋白存在一个十分保守的丝氨酸残基作为一个磷酸化的位点，对于SPL蛋白的转录活性是必要的。因此，作者构建了一个多克隆的抗体靶向一个包含磷酸化的Ser163的14个氨基酸的多肽（S163-P）。aIPA1S163-P抗体能够高度特异性识别包含S163-P的IPA1。将S163改变为丙氨酸（S163A），移除了IPA1被磷酸化的能力，从而IPA1不能被aIPA1S163-P所识别。在稻瘟病菌侵染的ipa1-1D植株中，aIPA1S163-P检测的IPA1磷酸化模式与使用Phos-tag检测的模式类似，即在侵染12个小时后达到峰值，IPA1（S163-P）富集水平约是正常时的3倍（Fig. 2C）。野生型的植株也表现出了类似的IPA1磷酸化模式，但峰值的强度略低，大概是正常时的2倍。这些结果说明水稻在被稻瘟病菌侵染时IPA1 S163被磷酸化的模式与IPA1整体被磷酸化的模式类似。

3. IPA1磷酸化后通过上调WRKY45基因参与疾病抗性调控

作者近一步通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）鉴定IPA1-GFP植株中能被IPA1上调表达的基因。作者发现包括WRKY45在内的防御响应相关的基因上调表达。WRKY45基因作用于水稻由苯并噻二唑诱导的和NLR蛋白介导稻瘟病菌免疫，其表达水平的提高能够增强水稻的抗性。因此，WRKY45基因表达量的提升可能参与了IPA1过表达植株中病原菌抗性的提升。在WRKY45基因启动子区鉴定到了两个包含GTAC序列的SPL结合位点。不出所料，任何带有这两个位点的探针能够在体内和体外实验中结合IPA1。在IPA1-GFP植株中过表达IPA1基因增加了WRKY45基因的表达，说明了IPA1激活了WRKY45基因的启动子。此外，相比于野生型，在ipa1-1D植株中由稻瘟病侵染所诱导的WRKY45基因表达更加强烈，但在RNAi干扰植株中相对偏弱（Fig. 3A）。这些结果说明WRKY45基因参与了IPA1介导的水稻稻瘟病抗性。相反，一个由IPA1促进的与产量相关的基因DEP1受到稻瘟病菌侵染的抑制（Fig. 3B），说明稻瘟病菌诱导的磷酸化可能改变了IPA1的DNA结合活性。

4. IPA1磷酸化前后的DNA结合特异性发生改变

为了检测稻瘟病菌侵染诱导的IPA1磷酸化是否改变了IPA1的结合活性，作者首先创制了两个IPA1突变体，IPA1（S163A）和IPA1（S163D）。S163A废除了IPA1的磷酸化能力，S163D与S163-P十分相似，且不改变IPA1的核定位。电泳迁移率测定试验EMSA显示IPA1（S163D）结合到DEP1和WRKY45基因启动子区GTAC位点的能力降低，而IPA1（S163A）几乎没有什么影响（Fig. 3C）。除了GTAC序列之外，作者还鉴定到了一个TGGGCC/T基序，在IPA1染色质免疫沉淀测序试验中显著富集。IPA1（S163D）增强了结合到TGGGCC基序上的能力，该基序在WRKY45基因启动子区存在，而DEP1则没有（Fig. 3C）。IPA1（S163A）与野生型较为类似（Fig. 3C）。作者进一步通过ChlP-定量PCR试验验证了IPA1（S163D）能够pull down更多的WRKY45基因TGGGCC序列（Fig. 3D）。因此，IPA1（S163D）优先结合到WRKY45基因启动子区的TGGGCC基序，而不结合到DEP1基因的启动子区。

5. IPA1 S163的磷酸化对于诱导WRKY45基因表达和抗性增强至关重要

为了进一步确认植物中S163磷酸化不同的DNA结合活性，作者构建了水稻IPA1（S163D）过表达植株（S163D-OE）和IPA1（S163A）过表达植株（S163A-OE），以评估二者在水稻免疫中的效应。结果显示IPA1 S163D-OE植株病变组织更小，而IPA1 S163A-OE则没有显著的效果（Fig. 4A-D）。另外，S163D-OE植株中WRKY45基因的RNA水平提升了6-7倍；相反，S163A-OE植株中DEP1基因的表达受到激活，而WRKY45基因的表达不受影响（Fig. 4E）。这些结果显示IPA1（S163D）诱导了WRKY45基因的表达，激活了植株的免疫，说明IPA1 S163的磷酸化对于诱导WRKY45基因的表达和增强植株免疫至关重要。此外，ipa1-1D植株中由稻瘟病菌侵染诱导的WRKY45基因表达上调和IPA1 S163磷酸化遵循相同的模式（Fig. 2），进一步说明了S163磷酸化的重要性。

Conclusion

综上，作者在本文发现单个蛋白IPA1同时促进水稻植株的产量和抗性，并且揭示了其同时调控两种不同生物学同路的分子机制。本文中，作者提出了一个ipa1-1D植株中IPA1功能实现的模型。在没有病原菌侵染的情况下，IPA1在163位丝氨酸的位点上并未发生磷酸化，此时IPA1会结合并激活DEP1基因的表达，促进植株的生长和产量。在植株受到病原菌侵染时，IPA1在163位丝氨酸的位点上发生磷酸化作用。磷酸化的IPA1改变了DNA结合的特异性，转而结合到了WRKY45基因启动子区的TGGGCC基序，激活了WRKY45基因的表达，最终导致了水稻对稻瘟病菌的抗性增强。因为IPA1的组成型磷酸化会降低水稻的产量，IPA1会在病原菌侵染后的48小时恢复到非磷酸化的状态，以激活植株生长发育和高产所需的基因。通过这样的模式，IPA1在没有病原菌侵染的情况下促进植株的生长和产量，而在病原菌侵染时提升植株的疾病抗性。野生型植株中的IPA1与ipa1-1D植株有着相同的磷酸化模式，但在幅度上有所减小。因为ipa1-1D植株在有着更高的非磷酸化水平的IPA1用于促进高产，同时也有着更高的磷酸化的IPA1用于疾病抗性，因此ipa1-1D植株同时在产量和抗性上均具有优势。此外，通过单个氨基酸的磷酸化作用改变其DNA结合特异性以此来精确调控不同的生物学过程，这可能是一个通用的生物学机理。