博文
高灵敏度支原体检测试剂盒说明书
||
【产品规格】
BPMPro100 100 Reactions/盒
【产品说明】
支原体(Mycoplasma)：目前发现的最小原核生物，据统计约15~35% 的细胞被支原体污染。支原体污染会改变宿主细胞的结构与功能，易致实验结果不稳定，须对培养细胞定期进行支原体检测。
本试剂盒采用双色荧光 qPCR (TaqMan 探针法) 检测支原体DNA。检测对象为细胞培养的上清液，细胞沉淀或其他生物制品。该试剂盒具有以下特点：
灵敏：配合推荐使用的核酸抽提方案，检测灵敏度达到10CFU/ml。
可靠：抽提加入内标核酸，全过程质量控制。
稳定：全程闭管操作，无交叉污染。
方便：操作简单，无需电泳步骤。
【有效期】
规定储存条件下6个月。
-20 ℃取出后，可避光存放于4 ℃继续使用1周。
【产品组分】
表1 产品组分
组分名称 | 装量 | 储存条件 |
Biowing® MyqPCR Reaction Mix1 | 475 ul×2管 | -20 ℃，避光 |
Biowing®MyPrimer&Probe Mix2 | 25 ul×2管 | -20 ℃，避光 |
阳性质控（PC) | 50 ul×2管 | -20 ℃ |
内部质控（IC) | 50 ul×2管 | -20 ℃ |
RNase Free Water | 50 ul×2管 | -20 ℃ |
石蜡油 | 750 ul×2管 | -20 ℃ |
注：
1、阳性质控含有支原体DNA和内标DNA。
2、内部质控含有内标DNA。
在实验前请完整阅读本说明书，务必重视注意事项和无菌操作规范！
【操作步骤】
1.样本制备
（1）样本的标准制备方案：请配合使用高效无微生物污染的DNA抽提试剂盒提取样本DNA。整个过程需要遵守无菌操作规范。本公司目前推荐抽提试剂盒见附录3。直接取20 μL待测样本DNA，作为模板进行 qPCR 反应。
（2）前处理阴性样本准备方案：将RNase Free Water当成样本，加入内部质控，进行核酸抽提。
2. qPCR 反应液的准备
（1）根据所要检测样品的数量，计算所需反应孔数，每个样本做3个重复孔。
反应孔数=1个阳性PCR质控+1个阴性PCR质控+1个前处理阴性质控+样本数× 3
（2）根据反应孔数计算所需的qPCR Mix 总量（需有1孔的加样损失量）：
Mix =（反应孔数+1）×10 μl
各试剂放室温融化，并根据下表所示准备 qPCR Mix：
表2 qPCR Mix的配制
组分/样品管 | Biowing® MyqPCR Reaction Mix1 (μL) | MyPrimer& Probe Mix2 (μL) | 总体积 (μL) |
1人份 | 9.5 | 0.5 | 10 |
N人份 | 9.5N | 0.5N | 10N |
1. 加样
（1）震荡混匀 qPCR Mix，低速离心，将管盖残留液体收集至管底。
（2）向每孔反应管中分装 10 μL qPCR Mix。
（3）向已分装过 qPCR Mix 的反应管中加入15 ul石蜡油。
（4）向反应管中加入样品后短暂离心，加样示例如下：
表 3 加样示例
PCR模板 | qPCR Mix | 总体积 |
PC 20 μL | 10 μL | 30 μL |
qPCR 阴性20 μL | 10 μL | 30 μL |
前处理阴性20 μL | 10 μL | 30 μL |
样本A重复1 20ul | 10 μL | 30 μL |
样本A重复2 20ul | 10 μL | 30 μL |
样本A重复3 20ul | 10 μL | 30 μL |
【注】：此时每个反应孔的体积为30μL。
qPCR 阴性的PCR模板为20 ul RNase Free Water。
PCR 仪设置以 ABI 7500 为例，相对定量模式，选择
TaqMan 探针法：
步骤 | 循环数 | 温度 | 时间 | |
1 | 预变性 | 1 | 94℃ | 5 min |
2 | 变性 | 15 | 95℃ | 10 s |
退火与延伸 | 65℃ | 90 s | ||
3 | 变性 | 25 | 95℃ | 10 s |
退火与延伸 | 65℃ | 30 s | ||
65℃延伸时收集荧光信号 | ||||
通道选择：样本检测通道-FAM；内参检测通道-HEX，无 HEX 通道，可使用VIC 通道。ABI 系列荧光定量 PCR 仪 需 ROX 校准，Passive reference 选择ROX。 | ||||
注：1、该程序为两阶段扩增法，如荧光定量PCR仪可以两阶段收集荧光，按照正常Ct值判断结果；如果只能最后一步收集荧光，需要在原数据的基础上加15个Ct值。
2、ROX设置是以7500为例，但也存在例外，例如StepOne。
【阈值设置】
以ABI 7500 为例，扩增曲线选择 log 法，如果不能两阶段收集荧光，基线设置1~2个循环；如果可以，基线设置3-15个循环。建议用 log 法扩增曲线保证结果稳定可靠。
（1） 内参(HEX/VIC)阈值设定：以阳性对照定内参扩增曲线阈值，将内参的Ct 值定为 28±2。
（2）支原体(FAM)阈值设定：以阳性对照定支原体扩增曲线阈值，将支原体(FAM)的 Ct 值定为 28±2 。
【实验质量控制】：
如果阳性对照管的支原体(FAM)Ct 值>30，但阳性对照管及前处理阴性对照管的内参(HEX)Ct 值正常，表明阳性支原体对照模板有降解。
如果样品前处理阴性的内参（HEX/VIC)Ct 值>30，阳性对照管的内参(HEX)Ct 值>30 ，表明内参DNA存在降解或PCR体系扩增效率下降。
【结果判读】
根据支原体(FAM) Ct 值、内标(VIC) Ct 值判定，具体标准如下：
PCR 模板 | 支原体(FAM)Ct 值 | 内标(VIC) Ct 值 | 判定说明 |
阳性对照 | ≤30 | － | 阳性成立 |
>30 | － | 阳性不成立 | |
qPCR阴性对照 | ≥37.5 | ≥37.5 | 阴性成立 |
＜37.5 | ＜37.5 | 阴性不成立 | |
样本前处理阴性 | ≥37.5 | ≤30 | 阴性成立 |
待测样品反应孔 | ＜37.5 | ≤30 | 阳性 |
≥37.5 | ≤30 | 阴性 |
要求每个检测样品做3重复，如果3复孔中，两重复为阳性，则判读为阳性；建议做样本前处理阴性，可以质控整个抽提过程。
注：检测结果异常时：
1. 样品前处理阴性：内参Ct值过大，表明抽提效率低；支原体检测通道Ct值小于37.5，可能前处理抽提过程存在污染。
2. qPCR阴性：支原体和内参检测通道Ct值小于37.5，操作过程存在污染。
3. 样本前处理阴性质控和PCR阳性质控内参差1±1个Ct值属于正常现象。
【 PCR过程注意事项】
由于 PCR 反应非常灵敏，实验操作中应注意以下事项，以免发生DNA 污染：
1．试剂盒开启后，阳性质控和内部质控与试剂Biowing® MyqPCR Reaction Mix1、Biowing®MyPrimer&Probe Mix2、RNase Free Water、石蜡油分开存放。
2．每个组分在使用前都应先低速离心后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用。
3．要求核酸抽提和qPCR过程都符合无菌操作规范。
4．建议自备转运盒，用于将配制分装好的Mix从配置Mix超净工作台转运到加样超净工作台。
5．建议在 qPCR 反应板上阳性对照的排布应远离待测样本和阴性对照。
6．建议 qPCR 配置与分装在一个无菌操作台，样本的加样在另外一个无菌操作台。
7．建议使用不同的移液器添加阳性对照与待测样本、阴性对照，并使用带滤芯的枪头进行加样。
8．应按照先加阴性，再加样本，最后加阳性的顺序加样。且阳性用专门的加样器。建议阳性在专门的无菌操作台加样。
9．qPCR 反应板封膜或盖盖子时须反复压紧。
10．上机扩增前，反应管短时低速离心，将管壁液体收集至管底
11．盖上反应管盖子或者贴上光学膜后，为避免影响荧光信号读取，请注意不要在管盖或者膜上做标记，或者用刮板反复摩擦。
12．本产品仅作科研用途。
https://blog.sciencenet.cn/blog-3140696-1387600.html
上一篇：翼和生物多重PCR技术助力大小鼠遗传质量鉴定
下一篇：Telo-Len 精确定量端粒长度
