粮食安全是中国乃至世界其他各国最为关注的重大战略问题，而种业是保障粮食安全的基础。现在种业正向设计育种以及智能化育种（基因编辑育种、生物育种、人工智能等多重技术融合发展）大步迈进，实现育种4.0时代，而4.0时代将最终实现作物的精准定向改良。分子设计育种是多学科交叉实现的新型育种方式，我国科学家率先对水稻、小麦、玉米、大麦、油菜等农作物重要农艺性状实现了基因组编辑，并成功实现了目标基因的定点突变、替换、插入、单碱基突变等基因编辑操作，并建立了完善的CRISPR/Cas9基因组编辑技术体系。

植物基因编辑技术简介

目前，CRISPR/Cas9基因编辑技术，由于实验设计简单、试验周期短、成本低及基因组上广泛存在的sgRNA识别目标序列等特点而占据了基因编辑的主要市场，并广泛应用于创建突变体或突变体库、目标基因的功能验证（互补实验）、创建新的优良等位基因、创建新的种质资源、基因组定点修饰，缩短育种年限等方面。

CRISPR全称为成簇规律间隔的短回文重复序列，Cas9蛋白是一种能降解DNA分子的核酸酶，其中含有两个负责切割DNA双螺旋的活性位点。基因组DNA在被CRISPR/Cas9复合体特异性识别后Cas9核酸内切酶对目标基因组DNA双链进行切割，造成DNA双链断裂（DSB），而细胞中的同源重组修复(HDR)机制和非同源末端连接(NHEJ)机制再对DNA双链进行修复（图1）。在修复过程中会随机插入或删除核苷酸（InDel），单碱基突变（SNP），从而形成移码突变，最终造成目标基因功能的缺失，实现基因敲除。现在检测修饰后的DNA双链的方法主要有以下集中：1.Surveyor或者T7E1核酸酶分析；2.PCR-RFLP分析；3.高分辨率熔解曲线（HRM）分析；4.单链构象多态性（SSCP）分析；5.荧光PCR等。以上几种均只能检测到DNA双链是否发生突变，而要检测编辑基因的目标DNA序列，就需要通过PCR将目的位点扩增并送Sanger测序。但常规的Sanger测序方法只能将含有目标靶点的PCR产物克隆到质粒载体，每个样品取多个单克隆（5-6个）测序，传统测序费时费力费用又高。

图1  CRISPR/Cas9基因编辑的原理

  高等植物有着复杂的基因组结构，而且植物在演化过程中会出现不同的基因组结构变异，包括染色体数目变化，染色体重组，基因组大片段缺失插入、倒位、异位、重复等大型结构变异（图2）。因此上述变异在作物中也较为常见，如作物中多拷贝基因形成；多倍体小麦、燕麦、油菜、棉花、烟草、苹果、马铃薯、甘薯等作物的形成。对多拷贝基因及多倍体作物进行基因精准编辑时，常常需要对不同拷贝及不同位点进行定点靶向检测。在常规靶向的过程中又会遇到上述费时费力高费用的难题，而且不能完全对编辑后代大群体个体进行基因型筛查，不仅延长了实验进展，还会由于筛选前期（转基因T1或T2）由于未筛到载体序列而遗忘对部分真阳性突变植株的筛选。

图2 各类基因组结构变异的类型

图3  基因编辑后代高通量基因型鉴定技术方案

参考文献

[1] 景海春,田志喜,种康,李家洋.分子设计育种的科技问题及其展望概论[J].中国科学:生命科学,2021,51(10):1356-1365.

[2] Hazafa, Abu et al. “CRISPR/Cas9: A powerful genome editing technique for the treatment of cancer cells with present challenges and future directions.” Life sciences vol. 263 (2020): 118525. doi:10.1016/j.lfs.2020.118525

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