【学术快讯】南通大学刘东Cell Research发文证实NgAgo可用！但是是gene Knockdown而不是Gene editing！

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今年5月2日，Nature系列顶尖刊物《Nature Biotechnology》在线发表了河北科技大学生物科学与工程学院青年教师韩春雨副教授题为“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”的研究成果。简单地说，作者发明了一种新的基因编辑技术（NgAgo-gDNA），适合在人类细胞中基因组编辑，不同于已有最时兴的技术（CRISPR-Cas9）。后者通过RNA寻找替换序列，而新技术通过DNA作为介导寻找替换目标。韩更是声称相比CRISPR-Cas9有诸多优点，所以此结果一经发表便引起诸多关注，然而之后由于重复性问题屡遭质疑，最近更是有13个课题组实名声明无法重复韩春雨实验，随后河北科技大学更是发表官方声明回应质疑，力挺韩春雨。声称已经有独立于河北科技大学之外的机构运用韩春雨团队的NgAgo技术实现了基因编辑，该机构与韩春雨团队的合作正在洽谈中。

就在大家逐渐遗忘此事之际，南通大学刘东副教授却默默在Cell Research上Online了一篇关于NgAgo的Letter，助手君朋友圈更是有多人惊呼NgAgo要逆转，然而，读完此文，发现原来真相是……

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这是一篇Letter to the editor，那文章到底讲了啥呢？让我们一起来看看吧。

开头作者就说，嗯，NgAgo太牛逼了，也太热了，我也心痒难耐，于是想着咋蹭蹭热点。要不拿来在斑马鱼上做做？就拿斑马鱼的fabp11a这个基因来玩玩吧！

为啥子用这个基因呢？当然是因为这个基因重要啊！怎么重要？它可以调控葡萄糖和脂质的稳态，还跟炎症有关，最重要的是它在斑马鱼胚胎发育中的作用还不清楚啊！敲掉这个基因不仅能做篇文章，还顺带验证了NgAgo的可行性！想想都是超值啊！唉，我咋这么聪明呢~

嗯嗯，下面我们正经点！作者先设计了一个密码子优化过的NgAgo，并且在两头都加上了NLS序列（Fig. 1A）！又设计了两对5’磷酸化的ssDNA，分别靶向fabp11a的第二个和第三个外显子（Fig. 1B）。然后将这两个ssDNA分别和NgAgo-2nls的mRNA一起注射到单细胞时期的斑马鱼胚胎中，靠，其中有30%的表型不要太明显好吧（Fig. 1C/D）！

可激动死我了！让我平复一下心情先！赶紧来抽个进组DNA，然后把靶序列PCR出来送去测序。

我想等待结果的过程就想是中国广大剁手党等待自己双十一期间的快递一般吧！

然而结果是没有发现DNA层面的任何改变！！！不甘心！我再抽再送再抽再送……一共搞了57个，然并卵，没有！

作者终于接受了这个残酷的事实，不过，作者并没有去凑热闹署名质疑韩春雨，只在心里默默问候了数日之后，想想这段时间来的辛苦，还是不甘心啊！肿么办？明明有表型啊！做个qPCR吧！发现，擦，mRNA这不是降低了么？原来是Knockdown啊！作者把NgAgo突变失活之后还是可以作用！又经过多个花样玩法终于证明：在斑马鱼中，gDNA/NgAgo主要是通过Knockdown的机制来影响基因功能的！由于失活的Cas9（dCas9）:sgRNA可以通过结合到编码序列上有效的抑制基因表达，所以，我猜，gDNA/NgAgo也是通过结合到基因上阻止其转录从而影响到基因的表达的吧！

所以，NgAgo在斑马鱼中确实可用！但是是用来做基因的Knockdown！！！

作者简介

刘东，于2011年获德国马克斯-德尔布吕克分子医学中心(Max-DelbrückCenterforMolecularMedicine)/柏林自由大学(FreeUniversityofBerlin)，自然科学博士学位（magnacumlaude）。从2012年8月起任南通大学神经再生重点实验室副教授，2013年起担任硕士研究生导师。中国解剖学会再生医学专业委员会委员，江苏省发育与细胞学会理事。主讲本科生《分子生物学》和研究生《高级分子生物学》课程。主要研究方向为：

1、鉴定参与血管新生以及神经系统发育过程中的全新的调控分子。

2、组织再生过程中血管化的过程及调控机制。

3、利用多种遗传操作技术建立转基因和基因敲除斑马鱼模型。

4、筛选调控血管内皮细胞和运动神经元行为的天然化合物。

发表的论文：

1.WangX, Ling CC, Li L, Qin Y, Qi J, Liu X, You B, Shi Y, Zhang J, Jiang Q, Xu H, SunC, You Y, Chai R, Liu D. Microrna-10a/10b represses a novel target gene mib1 toregulate angiogenesis. Cardiovascular research. 2016;110:140-150(通讯作者)

2.WangX, Wang X, Yuan W, Chai R, Liu D. Egfl6 is involved in zebrafish notochorddevelopment. Fish physiology and biochemistry. 2015;41:961-969(通讯作者)

3.WangX, Chong M, Wang X, Wang H, Zhang J, Xu H, Zhang J, Liu D. Block the functionof nonmuscle myosin ii by blebbistatin induces zebrafish embryo cardia bifida.In vitro cellular & developmental biology. Animal. 2015;51:211-217(通讯作者)

4.XuM, Liu D, Dong Z, Wang X, Liu Y, Baas PW, Liu M. Kinesin-12 influences axonalgrowth during zebrafish neural development. Cytoskeleton (Hoboken).2014;71:555-563(通讯作者)

5.WangX, Li L, Liu D. Expression analysis of integrin beta1 isoforms during zebrafishembryonic development. Gene Expr Patterns. 2014;16:86-92(通讯作者)

6.HuangY, Wang X, Xu M, Liu M, Liu D. Nonmuscle myosin ii-b (myh10) expressionanalysis during zebrafish embryonic development. Gene Expr Patterns.2013;13:265-270(通讯作者)

7.LiuD, Krueger J, Le Noble F. The role of blood flow and micrornas in blood vesseldevelopment. Int J Dev Biol. 2011;55:419-429(第一作者)

8.JiangQ, Liu D, Sun S, Hu J, Tan L, Wang Y, Gui Y, Yu M, Song H. Critical role ofconnexin43 in zebrafish late primitive and definitive hematopoiesis. Fishphysiology and biochemistry. 2009;36:945-951(第一作者)

9.JiangQ, Liu D, Gong Y, Wang Y, Sun S, Gui Y, Song H. Yap is required for thedevelopment of brain, eyes, and neural crest in zebrafish. Biochem Biophys ResCommun. 2009;384:114-119(第一作者)

10.LiuD, Wang YX, Hu JY, Sun SN, Song HY. The effects of connexin43 down regulationon the development of the embryonic heart and vasculature in zebrafish.Progress in Biochemistry and Biophysics. 2008;35:766-771(第一作者)

11.WangYX, Qian LX, Liu D, Yao LL, Jiang Q, Yu Z, Gui YH, Zhong TP, Song HY. Bonemorphogenetic protein-2 acts upstream of myocyte-specific enhancer factor 2a tocontrol embryonic cardiac contractility. Cardiovascular research.2007;74:290-303

12.SunSN, Gui YH, Wang YX, Qian LX, Jiang Q, Liu D, Song HY. Effect of dihydrofolatereductase gene knock-down on the expression of heart and neural crestderivatives expressed transcript 2 in zebrafish cardiac development. Chin Med J(Engl). 2007;120:1166-1171

13.KruegerJ, Liu D, Scholz K, Zimmer A, Shi Y, Klein C, Siekmann A, Schulte-Merker S,Cudmore M, Ahmed A, le Noble F. Flt1 acts as a negative regulator of tip cellformation and branching morphogenesis in the zebrafish embryo. Development.2011;138:2111-2120

14.KleinC, Mikutta J, Krueger J, Scholz K, Brinkmann J, Liu D, Veerkamp J, Siegel D,Abdelilah-Seyfried S, le Noble F. Neuron navigator 3a regulates liverorganogenesis during zebrafish embryogenesis. Development. 2011;138:1935-1945

15.SangQ, Zhang J, Feng R, Wang X, Li Q, Zhao X, Xing Q, Chen W, Du J, Sun S, Chai R,Liu D, Jin L, He L, Li H, Wang L. Ildr1b is essential for semicircular canaldevelopment, migration of the posterior lateral line primordium and hearingability in zebrafish: Implications for a role in the recessive hearing impairmentdfnb42. Hum Mol Genet. 2014;23:6201-6211

16.LiS, Liu Q, Wang Y, Gu Y, Liu D, Wang C, Ding G, Chen J, Liu J, Gu X.Differential gene expression profiling and biological process analysis inproximal nerve segments after sciatic nerve transection. PLoS One.2013;8:e57000

17.JiangQ, Lagos-Quintana M, Liu D, Shi Y, Helker C, Herzog W, le Noble F. Mir-30aregulates endothelial tip cell formation and arteriolar branching.Hypertension. 2013;62:592-598

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最后附上王永明老师评论：

文章是在斑马鱼里做的，不能切割，但是可以抑制基因表达，推测是结合到了基因上，阻止了转录。并没有支持或者反驳韩教授的结果。

NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish.pdf