16s建库过程中，由于序列彼此之间的相似度极高，会严重影响测序数据的质量，为了保证测序数据质量，会在库中加入较高比例的phix序列以增加文库中序列的复杂度，保证测序质量，但此策略会导致大量测序序列是phix序列，为此在测序量固定的情况下，为保证每个样品的数据量，每次测序可pooling的样本数会较少。针对这种现状，有不同的文章在尝试解决此问题：

文章：Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform

时间：2013  (http://aem.asm.org/content/79/17/5112.full)

杂志：Applied And Enviromental Microbiology

      此建库策略在于引物设计时：the Illumina adapter sequence、an index sequence (onlyfor the reverse primer) 、a 10-nt pad to prevent hairpin formation、a 2-nt linker that is noncomplementary to the 16S rRNA gene和a gene-specific prime，此策略是为了避免2步PCR带来的问题，increasing the risks of artifacts commonly observed with large numbers of PCR rounds. 此方法的特点是1）引物长，2）一步PCR即可得到产物，然后上机测序。但是这种策略本身带来的问题是样品混样时需要大量的index序列，dual-index可减少对barcode序列的需求，但却没有解决16s序列复杂度较低的问题。

文章：An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform

时间：2014 （https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/2049-2618-2-6）

杂志：Microbiome

      此文章的策略采用2步PCR，第一步PCR引物组成为Linker序列＋index＋spacer＋扩增引物，第二步PCR引物为测序接头＋Linker序列，此策略通过引入spacer碱基，增加序列复杂度，可以大幅度降低phix的比例，通过双index可以pool大量的样本。两步PCR带来的问题在于扩增次数的增多，扩增错误会增加。

文章：A novel ultra high-throughput 16S rRNA gene amplicon sequencing library preparation method for the Illumina HiSeq platform

时间：2017（https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-017-0279-1）

杂志：Microbiome

   此策略在上一种策略的基础上，外加了一个index，如此在保证序列复杂度的基础上，可以更大量的pool样品，相当于上一种策略形成若干个pool文库，通过这个外index混合更多的样品。