引言：

我们通常需要做基因或者其它DNA片段的定点突变来研究其功能，所以做好定点突变是分子生物学中的一项重要技术。今天，我将分享我自己做定点突变的经验，主要有两种方法，供大家参考。虽然Agilent推出很多快速定点试剂盒，但是主要原理类似。

方法一：一步法定点突变（直接以质粒为模板）

这种方法主要是用质粒为模板，所以为了扩增的效率，我们将正向引物和反向引物分开扩增，避免二聚体的产生。具体实验过程如下：

各20ul体系

18ul 混合物+2ul primer F

18ul 混合物+2ul primer R

在两个tube中配好反应体系后，置于PCR仪进行反应，反应程序为：

1. 98℃             1min

2. 98℃             10sec

3. 60℃(可调整)     20sec            

4. 72℃          根据质粒大小调整

steps 2-4       for 12 cycles

5. 72℃            5min

6. 4℃

反应完成后，将两个反应体系混合后成40ul体系，并且补加适量的高保真聚合酶（如Q5），然后使用以上反应程序继续反应16 cycles。

得到的PCR产物加入1ul DpnI 酶和4ul的10*NEB cutsmart buffer消化模板质粒（原理是DpnI 酶只消化甲基化的DNA）置于37度反应1h。

取5ul跑胶看是否有条带，剩余的取部分做细菌转化，涂板。

12h后挑取3-5个克隆送测序。

注意点：1.设计引物时在突变位点两端各延伸20bp左右。

2.尽量用较小的质粒模板（可以将你的目的基因提前亚克隆到较小的载体）

3.避免使用有复杂序列的质粒做模板（如含有可包病毒的载体，含有重复序列）

方法二：搭桥法（线性DNA的定点突变）

这种也是比较常用的做基因定点突变的方法，主要原理是通过四对引物扩增出有重叠的序列，然后通过重叠延伸得到完整的序列。

这种方法的原理：

注意点：扩增的序列尽量不要太长，否则成功率不高。